Este protocolo aborda a análise de amostras limitadas obtidas de microbioreatores para extrair informações vitais sobre os atributos críticos de qualidade dos produtos. Outra vantagem dessas técnicas é que eles usam tempos mínimos de análise para determinar os principais atributos que ditam os parâmetros de qualidade do produto fabricado. O procedimento de demonstração será David Powers, Talia Faison e Phillip Angart, pesquisadores do meu laboratório.
Comece abrindo o software ligado ao sistema de purificação e colocando tubos cônicos de 15 mililitros para coletar o eluato de anticorpos purificados e tubos cônicos de 50 mililitros para coletar o fluxo durante a lavagem de sal alto no coletor de frações. Em seguida, adicione 0,22 micrômetros filtrados fluido de cultura celular colhida a uma seringa vazia de 12 mililitros com um bocal tampado. Depois de remover a tampa, insira o bocal de seringa na porta de injeção manual do sistema de purificação.
Torça a seringa para apertá-la no lugar e deprimir o êmbolo até que todo o volume da amostra tenha sido injetado e esteja visível no loop de amostra de grande volume de 10 mililitros. Selecione o método salvo e clique em Executar quando solicitado pelo software de instrumento. Quando todo o anticorpo tiver sido iludido, neutralize imediatamente a proteína purificada com uma base molar tris para um pH de cerca de 5,5.
Para concentrar o anticorpo purificado por centrifugação, coloque 100 filtros kilodalton em tubos de coleta de filtrados. Lave os filtros com 500 microliters de água dupla destilada e, em seguida, centrífuga. Repita a lavagem do filtro duas vezes.
Após a segunda lavagem, descarte o filtrado e transfira os filtros enxaguados para novos tubos de centrífuga. Em seguida, adicione 500 microliters de amostra a cada filtro para centrifugação. No final do giro, inverta o filtro em um novo tubo de coleta para obter a amostra concentrada com uma centrifugação final.
Para rotulagem e isolamento n-glicano, diluir 7,5 microliters de cada amostra de anticorpos concentrados. Com 15,3 microliters de espectrometria de massa cromatografia líquida ou água de grau LCMS em tubos de um mililitro do kit, e desnaturação dos anticorpos com seis microlitadores de uma solução de 5% de um surfactante amigável à espectrometria e espectrometria de massa a 90 graus Celsius por três minutos. No final da desnaturação, permita que as amostras esfriem até a temperatura ambiente por três minutos antes de adicionar 1,2 microliters de peptídeo N-glicosidase F para uma incubação de cinco minutos a 50 graus Celsius.
Após o resfriamento das amostras por três minutos à temperatura ambiente, rotule as amostras com 12 microliters de reagente fluorescente de marcação dissolvido em dimetilaformamida anidro por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, diluir a mistura n-glica rotulada com 358 microliters de acetonitrilo e colocar uma placa de cromatografia de interação hidrofílica em um coletor de vácuo com calços e bandeja de resíduos. Condicionar os poços com 200 microliters de água com o vácuo ajustado para 10 a 15 quilopascals para garantir que o líquido leve de 15 a 30 segundos para passar pela resina de cromatografia de interação hidrofílica.
Equilibre os poços com 200 microlitres de 85% de acetonitrilo por 15 a 30 segundos antes de carregar 400 microliters de cada mistura de gliccano rotulado em cada poço, aplicando o vácuo após cada novo líquido ser adicionado. Quando todas as amostras tiverem sido adicionadas, lave a resina duas vezes com 600 microlitadores de ácido fórmico de 1% e 90% de acetonitrilo por lavagem e substitua a bandeja de resíduos por tubos de coleta de 600 microliteres. Em seguida, iluda os N-glicacanos rotulados com três volumes de 30 microliteres de tampão de elução de espectrometria e diluir as diluições da piscina com 310 microlitrais de dimetilformamida em eluente amostrado de acetonitrilo.
Para analisar as amostras de elução N-glycan rotuladas em um sistema de cromatografia líquida ultraperformance acoplado a um detector de fluorescência e tempo quádruplo de espectrômetro de massa de voo, use 50 milimônios formato e acetonitrila de grau 100% LCMS para as fases móveis. Defina a taxa de fluxo inicial para 0,4 mililitros por minuto, com o gradiente LC fornecendo formato crescente de amônio durante a fase de eluição. Defina o detector de fluorescência para medir uma excitação de 265 nanômetros e uma emissão de 425 nanômetros com uma taxa de amostragem de dois hertz.
Defina o tempo quádruplo de voo para o modo de sensibilidade de íons MS1 positivo com uma faixa de massa de 100 a 2.000 Daltons, um tempo de varredura de 0,25 segundos, e uma aquisição de dados contínuos. Em seguida, carregue as amostras no sampler automático definido a 10 graus Celsius e execute o método carregado. Para desalar uma amostra em preparação para a análise da variante de carga, tire a rolha inferior de uma coluna de desalagem de 0,5 mililitro, solte a rolha superior e coloque a coluna de desalagem em um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro.
Transfira a nova coluna para um novo tubo de microcentrifuuge e adicione 80 microliters de uma solução de anticorpos de 3,5 mililiteres para o topo da coluna. Alinhe a coluna à orientação original e centrifufique a coluna. Em seguida, descarte a coluna de desalagem e misture completamente a amostra concentrada.
Diluir a amostra para uma concentração de dois miligramas por mililitro em 25 microliters de água ultrauso em um único poço de uma placa de 96 poços e adicionar cinco microliters de tampão de rotulagem e cinco microliters de reagente de rotulagem ao poço. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente protegida da luz, misture 60 microliters de água de grau reagente com a amostra e cubra a placa com uma vedação de placa para centrifugação. Para preparar o chip da variante de carga, remova a solução de armazenamento e lave os poços um, três, quatro, sete, oito e 10 com água.
Substitua a água por tampão de funcionamento pH 7.2 e adicione 750 microliters de tampão de corrida ao tubo tampão. Pressione a placa de descarga na interface do usuário do instrumento e remova o selo da placa de 96 poços. Insira a placa e o tubo tampão nos pontos indicados na bandeja de amostra GX2 e pressione a placa de carga.
Coloque o chip na câmara do chip, feche a tampa da câmara do chip, selecione o ensaio da variante de carga de proteína HT quando solicitado e clique em Executar. A purificação da amostra de cultura celular colhida do bioreator de microescala automatizada por cromatografia líquida de proteína rápida permite a caracterização dos atributos críticos de qualidade das proteínas purificadas por vários métodos analíticos a jusante, como demonstrado. Os dados n-glycanos de anticorpos monoclonais produzidos pelo ovário chinês processados pela espectrometria de massa devem parecer semelhantes a esses cromatógramas representativos.
A dispersão de luz de múltiplos ângulos de exclusão de tamanho pode ser usada para avaliar o perfil de agregação e o peso molecular do anticorpo. A pequena quantidade de amostra e a importância da agregação são atributos críticos de qualidade para tornar essa técnica uma ferramenta analítica complementar altamente valiosa para o sistema microbioreator automatizado. O resultado da eletroforese da zona micro capilar é um eletroferóico e pode ser usado para mostrar o perfil da variante de carga para um anticorpo monoclonal, uma assinatura única para a proteína que está sendo investigada que é altamente sensível ao pH operacional.
O consumo de aminoácidos também pode ser monitorado para determinar se o esgotamento causa alterações nos atributos críticos de qualidade do anticorpo. É importante garantir uma purificação adequada e eficiente do produto fabricado, pois as etapas analíticas só podem ser realizadas com uma proteína devidamente purificada. O produto também pode ser submetido a testes de mapeamento de peptídeos e estabilidade.
Mas uma vez que a proteína foi usada para um método de caracterização, ela normalmente não pode ser usada para outro. Essas técnicas permitem a análise de produtos produzidos a partir de pequenas plataformas de triagem de bioprocessamento de alto rendimento para entender a influência dos parâmetros de bioprocessamento na qualidade do produto. Algumas dessas técnicas utilizam ácido polelorico concentrado, ácido fórmico, N-dimetilformamida, todas perigosas e devem ser manuseadas cuidadosamente durante o uso do equipamento de proteção adequado.
