Somos gratos a T. Huber e Sakmar TP para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por concessões do National Institutes of Health EUA a LBV ea Fundação Belgo-American Educational Foundation e Revson para ML

1. Equipamentos e reagentes Diluições odor: <ul><li> Óleo de parafina (Sigma, número CAS: 8012-95-1) </li><li> Odores dos disponíveis mais alta pureza, que provoca atração em Drosophila larvas 1. Neste artigo de vídeo, os animais foram testados com acetato de isoamila (Sigma, número CAS: 123-92-2). </li><li> Frascos de vidro de 1,5 ml com tampa de Teflon (Agilent Technologies) </li><li> Escala de medição digital para diluição precisos em peso </li></ul> Arena de ensaio de set-up: <ul><li> Agarose (Promega) </li><li> Tampas de 96 poços de microplacas (BD Falcon, número de catálogo: 353071). Nossa arena comportamental consiste em três tampas empilhados. </li><li> Single-channel pipeta 20/01 mL ou pipeta multi-canal para carregar gota odorant (s) na tampa superior da pilha. Para configurar o ensaio de múltiplas fontes, usamos 50-50 Pipete-Lite pipeta multi-canal de Rainin. </li></ul> Preparação de Drosophila larvas para testes comportamentais: <ul><li> 15% (w / w) solução de sacarose </li><li> Pratos regulares Petri (BD Falcon) para lavar e guardar as larvas </li><li> Pincel (4-5mm de comprimento cerdas) para manipular e transferência de larvas </li></ul> Gravação de movimento larval: <ul><li> Pequenos pinos com uma cabeça chata para a transferência de larvas na Arena </li><li> Fórceps ou pincel para remover larvas após a gravação </li><li> Palco iluminado com uma homogêneo não-aquecimento fonte de luz, &quot;Slim Edge&quot; Pad Luz fabricado pela Logan Elétrica </li><li> Gabinete para cercar a área de comportamento e controle de condições de luz </li><li> Sistema de vídeo monitoramento para a gravação de movimento animal. Estamos usando o software Ethovision (Noldus, Holanda). </li><li> CCD da câmera e placa de vídeo de quadros grabber (Piccolo EureCard Basic) adquiridos com Ethovision software </li><li> Termômetro e gravador de umidade para monitorar as condições atmosféricas durante os testes comportamentais (opcional) </li><li> Matlab (The Mathworks) para análise de dados personalizado (opcional) </li></ul> 2. Área comportamental A arena comportamental consiste em três empilhadas tampas de 96 poços prato. A tampa inferior é usado para isolar o resto do sistema a partir do bloco de luz e reduzir a convecção na arena. A tampa segunda, coberto com 25ml de 3% agarose gel, serve como um palco para as larvas a caminhar. A tampa superior tem o odor de gotículas que permanecem em suspensão pela tensão superficial. Gotículas de odor são pipetados diretamente nas cavidades da tampa prato de 96 poços. Um odor fontes únicas ou múltiplas pode ser usado para gerar gradientes com distintos, perfis verificáveis ​​2. Para testar a anosmia e defeitos de quimiotaxia em larvas, propomos usar o seguinte dois ensaios. 2.1. Ensaio única fonte odor: uma gota de odor único bem colocado no # E7 (padrão de 96 poços sistema de referência da placa). <ul><li> Estímulo: 10μl de odor diluído em óleo de parafina </li><li> Condições iniciais: a larva único é introduzido sob a fonte de odor (ou na sua vizinhança próxima). </li><li> Observações básicas: Para estímulos atraentes (por exemplo, acetato de isoamila), larvas de tipo selvagem acumular debaixo da fonte. Anósmico animais ou animais sujeitas a defeitos olfativa rapidamente se afaste da gota. </li><li> Duração de um julgamento: 3 min. O movimento de um determinado animal é registrado até o tempo de julgamento tem decorrido ou assim que os contatos de animais na parede da placa. </li><li> Métricas possíveis para a quantificação comportamental: porcentagem de tempo gasto por um animal em uma pequena zona circular centrada na fonte de odor, média distância para a fonte de odor; curso de tempo da distância à fonte de odor, etc </li></ul> Este ensaio eficiente testes para anosmia básica em larvas mutantes. Também pode ser usado para fiavelmente determinar o limiar de detecção de odores particulares 2. 2.2. Ensaio de múltiplas fontes de odor Gotículas odor várias são colocados no poço da tampa superior. No artigo de vídeo presentes, montamos gradientes ao longo da linha central E. Um total de seis gotas foram introduzidos nos poços # E2, E4 #, # E6, E8 #, # E10 e E12 # (padrão de 96 poços sistema de referência da placa ). Em contraste com a placa de Petri e ensaios única fonte de odor, o teste de múltiplas fontes odor permite o controle qualitativo da geometria gradiente estabelecidas ao longo do comprimento e largura da arena. Este ensaio foi usado para caracterizar os mecanismos sensoriais permitindo que as larvas de Drosophila chemotax 2. <ul><li> Estímulo: gotículas odor 10μl são colocados em poços alternados ao longo de uma linha. Este arranjo leva à criação de um gradiente centrado linha selecionada. Para estabelecer um gradiente homogênea ao longo da largura da arena, várias linhas podem ser carregados com várias fontes. </li><li> Condições iniciais: a larva único é introduzido sob a fonte de odor entre os poços # E3 e #E4. </li><li> Fenótipos básicos: larvas anósmico vagar a esmo sob o ponto de partida. Para estímulos atraentes (por exemplo, acetato de isoamila), animais que são capazes de cheirar navegar ao longo da direção da concentração de odor crescente. A precisão com que um animal sobe a trilha de odor está correlacionada com a sua capacidade de perceber e processar os estímulos olfativos. Caminhos tortuosos são muitas vezes causados ​​por defeitos sensoriais. Uma vez que um animal alcançou o ponto de maior concentração no julgamento, ele permanece nas proximidades desta posição. </li><li> Duração de um julgamento: máximo de 3 min (períodos mais longos de acompanhamento tendem a introduzir ruído como larvas perdem o interesse e, eventualmente, abandonar o gradiente). Para os gradientes ilustrado neste artigo de vídeo, o movimento de um indivíduo larva foi registrada até que o animal atingiu o bairro da fonte de maior concentração (bem # E12). A gravação foi interrompida assim que o animal chegou à área-alvo ou contactado qualquer parede da arena. </li><li> Métricas possíveis para a quantificação comportamental: porcentagem de tempo gasto por um animal abaixo da linha de odores (retângulo azul); significa título com relação à direção local do gradiente de odor; uma pontuação combinada de quimiotaxia medir a tendência mundial de um animal para seguir o odorant linha 2. </li></ul> 3. Verificação do perfil do gradiente Antes de testar as larvas em um gradiente particular, é importante para determinar a sua estabilidade ao longo do tempo. Nesta base, o pesquisador pode determinar uma duração adequada para cada ensaio eo número de larvas que podem ser rastreados em seqüência na mesma arena. Para testar a estabilidade do gradiente, temos desenvolvido um método baseado na espectroscopia de IR 2. Este método está além do escopo deste protocolo e não será mais elaborada. 4. Protocolo para a preparação de um experimento 4.1. Preparação de agarose placa e diluições odor: <ol><li> 1. Despeje 25ml de agarose 3% para o plano superior de uma tampa prato de 96 poços; permitir que a agarose para esfriar e solidificar (~ 30 min). Importante: Certifique-se que as tampas de 96 poços estão em uma superfície plana antes de derramar a agarose como a presença de uma encosta sobre o solidificou agarose gel pode afetar o comportamento das larvas. Ao derramar o gel, retire as bolhas que se formam na superfície. </li><li> 2. Diluir odores para concentrações desejadas em óleo de parafina utilizando uma balança digital para medir com precisão as quantidades de óleo de parafina e odor em cada diluição. </li></ol> Notas: Quando as concentrações de baixo odor são usadas, é preferível preparar um conjunto de concentrações fonte baseado em diluições seriadas. Comece, por exemplo, com uma solução 1,0 M e realizar uma diluição de 1:02 para obter uma solução 0.5M. Ao proceder recorrentemente, obtém-se uma série de diluições após a 1.0M progressão geométrica, 0.5M, 0,25 m, 0.12M, 0,06 m, 0.03m, 0.015M. Importante: Uma vez que muitos odores orgânicos reagem com plástico, diluições odor deve ser armazenada em frascos de vidro com Teflon caps. Idealmente, os odores deve ser preparada antes de cada experimento para reduzir as flutuações na concentração de odor reais em experimentos. Isto é especialmente verdadeiro quando se utiliza produtos químicos altamente voláteis. 4.2. Preparação de larvas: <ol><li> 1. Prepare a solução de sacarose 15% em água destilada. Notas: A solução de sacarose 15% é mais denso do que as larvas e fará com que eles sejam impulsionadas para a superfície da solução. No entanto, pedaços de alimentos não dissolvido voam têm uma densidade maior do que a solução e rapidamente vão para o fundo. Assim, usando esta solução de sacarose fornece um meio eficiente de separar as larvas dos alimentos. Solução de sacarose é um excelente meio de contaminantes biológicos, se a solução ficar turva que pode ser esterilizado por filtração para remover a contaminação. </li><li> Obter um frasco com 6 dias de idade larvas ou larvas no estágio de desenvolvimento desejado. Notas: Todas as nossas experiências sejam realizadas com 6 dias de larvas de idade (metade do terceiro estágio de desenvolvimento instar); larvas nesta fase de desenvolvimento são grandes o suficiente para facilitar a detecção com o nosso software de rastreamento, mas também altamente ativos. </li><li> Despeje a sacarose para dentro do frasco de alimentos contendo as larvas. </li><li> Usando uma espátula, quebrar e dissolver os alimentos voar suavemente para liberar as larvas. Larvas liberado vai flutuar até a superfície. </li><li> Aguarde alguns minutos para os blocos de alimentos voar para desviar para o fundo do frasco, então, despeje a sacarose e larvas em uma placa de Petri. Se a pré-selecção das larvas é necessário, os animais podem ser recolhidos por derramar o de sacarose através de um filtro. Larvas podem então ser transferidos para um prato de seleção com um pincel. </li><li> Deixe as larvas por aproximadamente 30 minutos na ssolução ucrose antes de prosseguir com testes comportamentais para permitir que os animais se habituam à solução de sacarose. Como larvas não aparecem para se alimentar de sacarose, os animais vão experimentar um estado de fome, que melhora o desempenho quimiotaxia. </li><li> A tampa da placa de Petri pode ser preenchido com água (ou sacarose) e usado como um receptáculo para animais descartados após testes comportamentais. </li></ol> 5. Protocolo para realizar gravações de comportamento 5.1. Set-up Arena: <ol><li> 1. Aplique gotas de odor para o lado de baixo (lado brotou) de uma tampa prato fresco de 96 poços. Importante: Para evitar a contaminação de odores e concentrações diferentes odor, uma tampa fresca deve ser usada para cada carregamento de set-up. Nenhuma das tampas contendo fontes de odor são reciclados após o experimento. Dependendo da faixa de concentração utilizada odor, gradientes odorant foram encontrados para ser estável somente por 10 a 20 minutos em um sistema fechado. Portanto, é importante para minimizar o tempo entre gradiente set-up eo início real do teste comportamental. </li><li> Inverter a tampa e empilhá-la acima de uma tampa segunda revestido com a camada de agarose 3%. Importante: Inverter a tampa com cuidado para evitar gotículas odor se espalhe para poços adjacentes. </li><li> Após a inversão da pálpebra superior na superfície agarose, permitem que o odor se difundir por 30 segundos antes de introduzir a larva. </li></ol> 5.2. Larvas de carregamento: <ol><li> Levante a tampa superior contendo as gotas odorant apenas o suficiente para permitir o carregamento da larva. </li><li> Transferência de uma larva da solução de sacarose para a camada de agarose. A posição inicial do animal depende do ensaio a ser utilizado: Para o ensaio único odor fonte, as larvas são liberadas sob a gota de odores. Para o ensaio múltiplas odor fonte, as larvas são liberadas entre os poços # # E3 e E4. Importante: Orient os animais recém-introduzidos de forma consistente. Orientamos nossos animais na direção do gradiente, garantindo que o corpo do animal e cabeça, rosto a maior concentração. Animais introduzidos em um oposto orientação para que o gradiente de iniciar um comportamento de procura. Em nossa opinião, este período inicial de pesquisa representa uma fonte desnecessária de ruído. Controlar a orientação da cabeça reduz o número de animais que em contato com o muro arena durante o seu comportamento exploratório. Esta prática não a direção principal do movimento do animal ou aumentar significativamente o número de animais anósmico chemotaxing ao longo da linha odorant por acaso (ou seja, resultados falso-positivos em testes de cheiro). </li><li> Recoloque a tampa superior e iniciar a gravação prontamente. Notas: larvas saudáveis ​​iniciar o rastreamento imediatamente após a sua introdução na arena e pode cobrir uma distância de um centímetro nos primeiros 10 segundos. Se o experimentador é lento em iniciar a gravação, datapoints inicial será perdido. Por este motivo, recomendamos que o pesquisador se torna bem familiarizado com os comandos de software para iniciar a gravação antes de tentar executar um experimento. </li><li> Permitir que a larva se comportar durante o tempo da gravação (normalmente 3 minutos). Notas: As gravações são terminadas antes do final do 3 min se a larva atinge a parede arena ou atinge uma área-alvo (como no ensaio de gradiente). </li><li> No final da gravação, prontamente levantar a tampa e retire a larva com uma pinça ou um pincel. Colocar os animais rastreados na água tampa placa de Petri contendo (ou sacarose). Importante: Gravado animais não são reutilizados. O prato de água é apenas um receptáculo conveniente separar animais registrados e não-registradas durante a execução dos experimentos. </li><li> Se o controle de vários animais sob uma arena set-up, prontamente carregar a larva seguinte e iniciar a gravação como mostrado acima. Importante: O número de ensaios realizados na mesma arena set-up deve ser decidida com base na estabilidade gradiente que deve ser verificado antes de realizar qualquer experimento comportamental 2. </li><li> Uma vez que todas as larvas a serem testadas sob a arena set-up foram rastreados e retirado da arena, descarte a tampa superior e camada de agarose. A tampa intermediária (isto é, a tampa agarose) podem ser reciclados. Nota: Aconselhamos os usuários Ethovision para escolher o método de &quot;subtração de fundo&quot; de detecção. </li></ol> 6. Experimentos de exemplo demonstrado no artigo de vídeo 6.1. Ensaio única fonte de odor com 1.0M de acetato de isoamila. Nós cegamente testaram dez Or83b-/ - mutantes e dez do tipo selvagem (W1118) larvas para cada um dos quais um número tinha sido atribuído. O experimento de rastreamentoer não recebeu qualquer informação sobre o genótipo de cada animal. Depois de cada gravação, um fenótipo preditivo foi atribuído a cada animal testado: smellers, se foi observada acumulação sob a fonte de todo o julgamento, não smellers, se o caminho rapidamente deixou o bairro da fonte de odor. Depois de ter registrado o comportamento de 20 animais, os caminhos foram agrupados de acordo com o fenótipo. O resultado deste agrupamento foi então comparada com o genótipo real das larvas: todas as atribuições feitas foram encontrados para ser correto. 6.2. Ensaio de múltiplas fontes de odor com gradientes exponencial e linear de acetato de isoamila. Neste experimento, foram comparados os desempenhos de larvas do tipo selvagem chemotaxing ao longo de um gradiente linear e uma exponencial. Comportamentos quimiotáticos foram registrados por dois gradientes configurado com a maior concentração de 0,5 M mesmo. Como explicado no artigo, as fontes de odor do gradiente exponencial variou entre 0,015 e 0.5M. As fontes do gradiente linear variaram entre 0,25 e 0,5 M (progressão aritmética com a diferença comum 0,05 M). O gradiente linear representado um ambiente mais desafiador quimiotaxia como a diferença na concentração de locais era constante e relativamente pequena, ea faixa de concentração estreito (0,25 m). Em contraste, a faixa de concentração do gradiente exponencial foi maior com o aumento diferenças locais de concentração ao longo da trilha. Quinze larvas foram registrados para cada uma das duas geometrias gradiente e os caminhos sobrepostos em um gráfico. A inspeção visual dos dois gráficos mostra que larvas do tipo selvagem foram capazes de subir de forma confiável o gradiente para ambas as geometrias, mas que a quantidade de meandros foi maior para a condição de gradiente linear. Isto sugere que o sinal presente ao longo da extensão de gradiente é mais confiável para detectar uma forma exponencial do que para uma linear. 6.3. Ensaio de múltiplas fontes de odor com gradiente de acetato de isoamila em um &quot;teto&quot; de geometria. Aqui verificamos que as larvas introduzido em um gradiente de odor são sensíveis às mudanças locais da concentração de odor, em vez de apenas a presença ou ausência de odor. Um gradiente isoamílico foi estabelecido pela aplicação de gotas de odor com as seguintes concentrações: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0.12M. A geometria gradiente que se seguiu parecia um &quot;teto&quot; assimétrica atingindo um máximo de 0.5M. As larvas foram lançados entre as gotas de odor 0,06 m e 0.12M. Nossa hipótese era que, se as larvas eram meramente de computação a presença de odor que se seguiria o gradiente inteiro sem uma preferência especial para o máximo de concentração. Em contraste, as larvas se são sensíveis às mudanças locais da concentração que se acumularia sob a gota de 0.5M. Quinze larvas foram registradas, e verificou-se que, após um curto período exploratório todas as larvas acumuladas por baixo da maior concentração também. Isto sugere que as mudanças locais da concentração de odor são computados e informar o comportamento de larvas de Drosophila quimiotáticos.

<ol>
	<li>Fishilevich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+behavior+mediated+by+single+larval+olfactory+neurons+in+Drosophila.">Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila.</a> Curr Biol. 15, 2086-2096 (2005).</li><li>Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+olfactory+sensory+input+enhances+chemotaxis+behavior.">Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior.</a> Nature Neuroscience advance online publication. , (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

high-resolution measurement of odor-driven behavior in drosophila larvae

Respostas olfativas em larvas de Drosophila têm sido tradicionalmente estudado em placas de Petri compreendendo uma fonte de odor único periférico. Neste paradigma comportamental, o pesquisador geralmente assume que a rápida difusão de moléculas de odor da fonte leva à criação de um gradiente estável no prato. Estabelecer uma correlação quantitativa entre as entradas sensoriais e respostas comportamentais, é necessário para atingir uma caracterização mais aprofundada das condições de estímulo odorante. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

high-resolution-measurement-odor-driven-behavior-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K visualizações.  Rockefeller University. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

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Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissecação de discos imaginais de 3 larvas Drosophila Instar

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...