Gostaríamos especialmente de agradecer aos membros do laboratório Gerber para instruções técnicas sobre a sua configuração experimental e comentários sobre o manuscrito. Agradecemos também Lyubov Pankevych para o cuidado mosca e manutenção do estoque selvagem cantões tipo. Este trabalho é apoiado pela subvenção DFG TH1584/1-1, a concessão SNF 31003A_132812 / 1 e o Zukunftskolleg da Universidade de Konstanz (toda a AST).

1. Preparação <ol><li> Drosophila larvas tipo selvagem são criados a 25 ° C e 60% ​​a 80% de humidade num ciclo de 14/10 de luz / escuridão. Para controlar a idade exata das larvas sempre 20 fêmeas são colocados com 10 homens em um frasco (6 cm de altura e 2,5 cm de diâmetro), que inclui cerca de 6 ml de alimento mosca padrão. As moscas são permitidos para pôr ovos durante 12 horas e são transferidas para um novo frasco no segundo dia. 5-6 dias após a postura de ovos larvas atingir a alimentação 3 ª etapa instar se levantado a 25 ° C e pode agora ser usado para a experiência de comportamento. No entanto, tem de se assegurar que apenas tomar as larvas que estão ainda no alimento e as larvas não a partir do lado do frasco. Essas larvas já alcançaram &quot;vagando 3 º instar palco&quot; - pouco antes pupação - e seu uso dificulta a interpretação dos resultados. </li><li> Preparação de 2,5% de agarose pratos de Petri (outros laboratórios também usar concentrações de ágar de 1% durante todo o experimento, comoconcentrações cada vez menores podem permitir que a alimentação de larvas de 3 º a escavar o substrato): Dissolver 2,5 g de agarose em 100 ml DDH 2 O. Aquece-se a solução num forno de microondas até que comece a ferver. Cuidadosamente agite a solução e colocá-lo de volta no microondas até que todos agarose é dissolvido. Verter a solução de agarose quente em placas de Petri de tal forma que o fundo das placas de Petri é completamente coberto e a solução de agarose forma uma superfície lisa. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e coloque a tampa. Não feche imediatamente as tampas, porque permitiria a condensação de água nas tampas. </li><li> Preparação de 2M pratos de Petri de frutose: Dissolver 2,5 g de agarose em 100 ml DDH 2 O (de novo, o uso da concentração de ágar a 1%, é possível, no entanto, pode permitir a alimentação 3 de larvas para escavar o substrato). Aquece-se a solução num forno de microondas até que comece a ferver. Cuidadosamente agite a solução e colocá-lo de volta para o microonda até que toda a agarose é dissolvido. Adiciona-se cuidadosamente 35 g de frutose dentro da solução quente, lentamente, agitar a mistura até o açúcar se dissolver, para evitar o retardo de ebulição. Verter a solução de frutose-agarose quente em placas de Petri de tal forma que a parte inferior é completamente coberto e a solução de frutose-agarose forma uma superfície lisa. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e coloque a tampa. Não feche imediatamente as tampas, porque permitiria a condensação de água nas tampas. </li><li> Preparação de 1-octanol recipientes (OCT) odor: Encher 10 ul de outubro pura num recipiente de teflon feitos odor e fechar com uma tampa que tem vários furos pequenos para permitir a evaporação do odor. Uma descrição detalhada dos recipientes é dada na Gerber e Stocker 2007. Prepare três recipientes de odor para outubro Recipientes de odores para permitir a evaporação de substâncias químicas inseridas, mas evitam que as larvas podem contactar directamente com eles. Assim, as experiências aqui descritas especificamenteabordar a aprendizagem olfativa em larvas sem perturbar efeitos colaterais gustativas. </li><li> Preparação de recipientes amylacetate (AM) odor: Diluir AM 1:50 em óleo de parafina. Encher 10 ul da diluição num recipiente personalizado odor made Teflon e fechar com uma tampa que tem vários furos pequenos para permitir a evaporação do odor. Prepare três recipientes de odor para AM. A diluição é importante por razões de ordem prática, isto é, para evitar uma forte preferência para um odor em relação ao outro que podem mascarar uma mudança aprendizagem dependente de preferência na relação entre os dois odores. A atracção igual para ambos os odores podem ter de ser confirmadas no laboratório antes da experiência feita com o teste descrito mais tarde (2.5), com os animais naive. Os valores aqui apresentados são baseados em várias publicações do laboratório Gerber, que foram recentemente reproduzidas por nosso laboratório 9,15,16. </li><li> Etiquetagem dos pratos de Petri: Antes das experiências de comportamento de todos os pratos de Petri tem de ser codificado. Isso significa que,frutose contendo placas de Petri tem que ser marcado, por exemplo, com um &quot;X&quot; ou um &quot;A&quot; e os pratos de Petri de agarose apenas com um &quot;Y&quot; ou &quot;B&quot;. Este código deve ser revelada ao pesquisador somente depois que todos os dados foram gravados. Ao realizar as experiências &quot;cegas&quot;, não é possível, portanto, que as expectativas do experimentador podem afectar o desempenho das larvas. Para facilitar a compreensão para o público grande no seguinte só vamos falar sobre os odores como estímulos condicionados (CS1 ou CS2) que, ou são recompensados ​​quando apresentado em um prato de Petri frutose (+) ou não-recompensado quando apresentado de agarose só Petri (-). </li></ol> 2. Formação açúcar Recompensa e Teste <ol><li> 30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Transferi-los para uma placa de Petri primeiro que contém algumas gotas de água da torneira e cuidadosamente movê-los para a frente e para trás, com um pincel. Transferi-los para uma segunda placa de Petri que contém também algumas gotas de tap water de verificar que nenhuma pasta de alimentos permanece no bodywall das larvas, caso contrário larvas seria capaz de experimentar o odor de alimentos durante o experimento. Isso provavelmente obscurecer o processo de aprendizagem e seu desempenho na situação teste. </li><li> Formação: Para treinar larvas aos odores associados com um taco de açúcar apetitivo o seguinte regime é aplicado. Coloque um recipiente odor outubro no lado esquerdo e direito de um &quot;X&quot; marcado - assim, a recompensa de frutose contendo (+) placa de Petri (experimento &quot;cego&quot;, para mais detalhes veja 1.6). Coloque o grupo de alimentação 30 3 o ínstar foram para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e espere por 5 min, enquanto que os animais são expostos a outubro Certifique-se de que as larvas não está preso dentro da gota de água e pode vencer a tensão superficial do mesmo. Por que as larvas podem se mover livremente sobre a placa de Petri e experimentar estímulos olfativos e / ou gustativa. </li><li> Formação: Remover as larvas da placa de Petri com um pincel humedecido e transferir om sobre uma placa de Petri segundo que é marcado com um &quot;Y&quot; - assim, agarose apenas (-) contendo prato Petri - e tem um odor AM recipiente localizado no seu lado esquerdo e direito. Fechar a tampa e espere por 5 min, enquanto que os animais são expostos a AM. </li><li> Formação: Repetir a 2,2) e 2,3), duas vezes, de modo que todos os 30 larvas de experiência de três ciclos de formação: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). Neste experimento CS1 representa outubro e códigos CS2 para AM. </li><li> Teste: Coloque um PM e um recipiente odor outubro nos sites opostos de uma placa de Petri de agarose-somente. Transfira os animais treinados para o meio do teste do prato de Petri. Fechar a tampa e espere por 5 min. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, o lado direito do meio e do prato de Petri de teste. </li><li> Repita os passos 2.1) a 2.5), com um segundo grupo de alimentação 30 3 rd larvas mas inverter os papéis experimentais de AM e outubro de tal forma que os animais recebem a formação seguinte: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). Neste experimento CS1 representa outubro e códigos CS2 para AM. </li><li> Arranjos possíveis para a formação. Acima apresenta-se uma formação que existe em três ensaios de formação de um ou outro OCT / (+) - AM / (-) ou no grupo recíproca também de três ensaios de formação de AM / (+) - OCT / (-). No entanto, para evitar os efeitos dependentes da sequência durante a formação, é importante variar a sequência dos estímulos em repetições seguintes da experiência completa. Através da variação da ordem CS1 ou CS2 e também a apresentação de recompensa no primeiro ou no segundo prato apresentado, quatro sequências diferentes para os ensaios de formação são possíveis: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Primeiro grupo </td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td><td> Recíproco grupo </td><td> CS2 / (+) - CS1 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (+) - CS2 / (-) </td><td></td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td></tr></tbody></table> Para evitar efeitos sistemáticos de estímulos do meio ambiente circundante experimental, deve-se realizar o teste em metade dos casos, que o OCT é apresentado do lado esquerdo e de AM para a direita. Na outra metade dos casos AM devem ser apresentados no lado esquerdo e no lado direito outubro. 3. Os testes para a tarefa relevantes sensório-motor Faculdades O desenho das experiências acima descritas permite a análise de odor-de-açúcar de aprendizagem no tipo selvagem de alimentação 3 de larvas por si só. No entanto, os investigadores no laboratório da vida diária geralmente usam dois ou mais diferentes grupos experimentais de larvas para comparar, se a aprendizagem olfactiva depende de um pargene cular, um conjunto específico de neurónios, um estoque mutante, uma dieta de alimentos especiais, diferentes condições de criação, produtos químicos tóxicos adicionados durante o desenvolvimento, etc Assim, em todos os casos em que dois ou mais grupos experimentais de larvas são testados deve-se fazer uma conjunto de experiências de controlo obrigatórias para testar, se os diferentes grupos de larvas mostram adequadas sensório-motor acuidade. Isto torna-se obrigatória a partir fenótipos potenciais não são, necessariamente, devido às habilidades reduzidas ou abolidas aos odores associados com açúcar. Em vez disso, o potencial de defeitos de aprendizagem pode ser baseada em defeitos em qualquer etapa do circuito sensório-motora no tratamento de odores e / ou açúcar. Ou por outras palavras, se uma larva mutante não é capaz de açúcar sentido, não é possível estabelecer uma memória de açúcar. Mas isso não permite concluir que a larva não consegue aprender. Em detalhe as experiências de controle a seguir tem que ser feito para testar a adequada outubro, AM e processamento de frutose de larvas transgênico. 1. Teste para ingênuo outubro prefecia 30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Coloque um recipiente único odor outubro de um lado de uma placa de Petri de agarose, adicionar as larvas para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e esperar por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar para a OCT fonte de odor. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste. 2. Teste de preferência AM ingênuo 30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Coloque um recipiente único odor AM de um lado de uma placa de Petri de agarose, adicionar as larvas para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e espere por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar para o AM fonte de odor. Subsequentemente contar o número de larvae no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste. 3. Teste de preferência açúcar ingênuo 30 Recolha de alimentação 3 de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Preparar placas de Petri que contêm 2,5% de agarose, de metade e de uma mistura de frutose-agarose 2M na outra metade. Adicionar as larvas para a placa de Petri, fechar a tampa e esperar por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar em direcção ao lado de frutose, contendo. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste. Preparação de pratos de Petri de meia meia: Preparar placas normais de agarose como descrito acima na secção 1.2. Quando a agarose pratos de Petri são cheias arrefecido, corte cuidadosamente o agarose ao longo do eixo vertical, com um bisturi. Remova um meio de agarose a partir de uma placa de Petri. Add uma solução de frutose-agarose quente (para a preparação ver 1.3), com a meia vazia da placa de Petri. Tenha cuidado para que as duas metades corresponder e não formar uma borda definida - isso afeta o comportamento de escolha larval e torna uma análise comportamental bastante difícil 4.. Sham treinamento Apesar dos testes se a alimentação transgênica 3 ª larvas são capazes de distinguir em um nível tipo selvagem entre outubro e ar (3,1), AM e ar (3,2) e açúcar e agarose pura (3,3), um conjunto adicional de experimentos de teste foi recentemente introduzido (para discussão ver Gerber e Stocker, 2007). O racional para estas experiências é o seguinte. Durante a formação das larvas passam por tratamento sucessivo em massa e odor e açúcar estimulação. Assim, é bem possível que o fenótipo observado aprendizagem é enganador (embora naïve odor e testes de percepção de açúcar estão num nível de tipo selvagem!). De facto, é possível que os animais transgénicos differ de larvas do tipo selvagem em relação à resistência ao estresse, motivação, adaptação, fadiga sensorial, a aprendizagem contextual, e as mudanças na saciedade. Assim, Michels et al. (2005) introduziu controles que testam se um mutante dado é capaz de (1) detectar AM versus um recipiente vazio odor se você tratar as larvas exatamente como durante o treinamento, exceto que você omitir a recompensa e apenas expor a tanto odores; (2) detectar outubro, após o mesmo regime, (3) detectar AM versus um recipiente vazio odor, se você tratar as larvas de uma forma de treinamento de como não ser que você omitir os odores e apenas expor a recompensa, e (4 ) detectar PTU após o mesmo regime. Para uma discussão abrangente e mais detalhes sobre os métodos consulte Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007). 4. Análise de Dados para a Aprendizagem Recompensa Açúcar <ol><li> Para avaliar os dados do protocolo de aprendizagem açúcar recompensa calcular um índice de preferência OCT (PREF OCT) para cada um dos dois reciprocidadecamente grupos formados: Para o primeiro grupo que recebeu outubro / (+) - AM / (-) formação: PREF outubro (outubro + /-AM) = (n º de larvas do lado de outubro - # de larvas do lado AM) / n º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio Para o segundo grupo que recebeu AM / (+) - OCT / (-) formação: PREF AM (+ / outubro) = (n º de larvas em AM lado - N º de larvas do lado de outubro) / n º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio </li></ol><ol start="2"><li> Calcular um índice de desempenho (PI) para os dois valores PREF de 4,1). O PI representa aprendizagem associativa por anulando efeitos perturbadores de odor e exposição punição, passagem do tempo e manipulação: PI = (PREF outubro (outubro + / AM) + PREF AM (+ / outubro)) / 2 Assim PIs pode variar de -1 a 1. Valores significativamente negativos representam aversivo de aprendizagem, enquanto que valores significativamente positivos descrever aprendizagem apetitiva. Um experimento completo geralmente é composto por 10 ou mais IPs. Os dados são visualizados como includin parcelas caixag todos os valores de um dado grupo experimental. 50% dos valores de estar localizado no interior da caixa, o índice de desempenho mediano é indicado como uma linha a negrito no interior da caixa de bigodes. </li></ol> 5. Análise de Dados para a Tarefa relevantes sensório-motor Faculdades <ol><li> Para avaliar os dados ao testar para o processamento adequado odor outubro calcular um índice de preferência outubro odor da seguinte forma: Odor PREF outubro = (# de larvas no lado OCT - # de larvas no outro lado) / n º de todas as larvas no interior das zonas esquerda, direita e metade </li><li> Para avaliar os dados quando o teste de percepção de odor adequada AM AM calcular um índice de preferência odor da seguinte forma: Odor PREF AM = (# de larvas no lado AM - # de larvas no outro lado) / n º de todas as larvas no interior das zonas esquerda, direita e metade </li><li> Para avaliar os dados ao testar para a percepção adequada frutose calcular um índice de preferência de frutose como segue: PREF frutose = (# de larvas no lado frutose - # de larvas no outro lado) / N º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio </li><li> Detalhes para a formação farsa são dadas em Michels et al. 2005. </li></ol>

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U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis.">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li><li>Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+electrical+properties+in+Drosophila+neurons+developing+without+synaptic+transmission.">Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission.</a> J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).</li><li>Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+odor+similarity+"space"+in+larval+Drosophila.">A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).</li><li>Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+attractiveness+and+associative+learnability+of+odors+can+be+dissociated+in+larval+Drosophila.">Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. , (2011).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cAMP+response+element-binding+protein-dependent+medium-term+memory+by+appetitive+gustatory+reinforcement+in+Drosophila+larvae.">Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+neuronal+networks+and+biochemical+pathways+for+appetitive+and+aversive+memory+in+Drosophila+larvae.">Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).</li><li>Khurana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Conditioning+in+the+Third+Instar+Larvae+of+Drosophila+melanogaster+Using+Heat+Shock+Reinforcement.">Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement.</a> Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).</li><li>Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+through+metamorphosis+in+normal+and+mutant.">Memory through metamorphosis in normal and mutant.</a> 14, 68-74 (1994).</li><li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning.">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li><li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47.">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li><li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> A configuração descrita em larvas Drosophila permite a investigação sobre a aprendizagem associativa olfativa dentro de um cérebro comparativamente elementar. A abordagem é simples, barato, fácil de estabelecer em um laboratório e não requer equipamentos de alta tecnologia 9. Nós apresentamos uma versão do experimento, para estudar a aprendizagem associativa apetitiva reforçado pela recompensa frutose 11. A configuração descrita baseia-se numa série de estudos paramét...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Número CAS </td></tr><tr><td> Frutose </td><td> Sigma </td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1-octanol </td><td> Sigma </td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td> Amylacetate </td><td> Sigma </td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td> Petróleo </td><td> Sigma </td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appetitive associative olfactory learning in drosophila larvae

A seguir, descrevemos os detalhes metodológicos da aprendizagem associativa apetitiva olfativo em larvas Drosophila. A configuração, em combinação com interferência genética, fornece um identificador para analisar as bases neuronais e moleculares da aprendizagem associativa especificamente no cérebro de um simples larval. Organismos podem utilizar a experiência passada para ajustar o comportamento presente. Essa aquisição do potencial comportamental pode ser definida como a aprendizagem, e as bases físicas destes potenciais como traços de memória 1-4. Neurocientistas tentar entender como esses processos são organizados em termos de alterações moleculares e neuronal no cérebro, usando uma variedade de métodos em organismos modelo, desde insetos aos vertebrados 5,6. Para tais esforços é útil usar sistemas modelo que são simples e acessíveis experimentalmente. A larva Drosophila acabou por satisfazer essas demandas com base naa disponibilidade de ensaios comportamentais robustos, a existência de uma variedade de técnicas transgênicas ea organização fundamental do sistema nervoso que compreende apenas cerca de 10 mil neurônios (embora com algumas concessões: limitações cognitivas, comportamentais, poucas opções e riqueza de experiência questionável) 7-10 . Larvas de Drosophila podem formar associações entre odores e reforço gustativa apetitivo como o açúcar 11-14. Num ensaio padrão, criada no laboratório de B. Gerber, os animais recebem um dois-odor formação recíproca: Um primeiro grupo de larvas é exposto a um odor que A juntamente com um reforçador gustativas (recompensa açúcar) e é subsequentemente exposto a um odor B sem reforço 9. Enquanto isso, um segundo grupo de larvas recebe formação recíproca ao experimentar odor Um sem reforço e subsequentemente serem expostos a B odor com reforço (recompensa açúcar). A seguir ambos os grupos são tested por sua preferência entre os dois odores. Preferências relativamente mais elevadas para o odor recompensado reflectir a aprendizagem associativa - apresenta-se como um índice de desempenho (PI). A conclusão sobre a natureza associativa do índice de desempenho é atraente, porque além de a contingência entre os odores e tastants, outros parâmetros, tais como odor e exposição recompensa, passagem do tempo e manuseio não diferem entre os dois grupos 9.

Figura 1A mostra uma visão geral dos procedimentos experimentais para a aprendizagem olfativa larval associativo. Por emparelhamento de um dos dois odores apresentados com uma recompensa larvas açúcar adquirir o comportamento potencial para expressar uma resposta atraente para o odor recompensado em comparação com o odor recompensa. Dois grupos de larvas são sempre treinados por qualquer emparelhar o reforço com o odor outubro ou AM. O índice de desempenho (PI) mede a função associativo como a...

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Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Larvas de Drosophila são capazes de associar estímulos odor com recompensa gustativa. Aqui nós descrevemos um paradigma comportamental simples que permite a análise da aprendizagem associativa apetitiva olfativo.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

appetitive-associative-olfactory-learning-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

18.9K visualizações.  University of Konstanz. Larvas de Drosophila são capazes de associar estímulos odor com recompensa gustativa. Aqui nós descrevemos um paradigma comportamental simples que permite a análise da aprendizagem associativa apetitiva olfativo.

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neurociência

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.