Reconhecemos Silke Sachse e Beate Eisermann no desenvolvimento desta metodologia, Pablo Traversa para desenhar os planos de blocos de montagem e Daniela Pelz para o uso do esquema na Figura 1. Somos gratos a Silke Sachse, Ramdya Pavan e Rytz Raphael para comentários sobre o manuscrito. R. Bell é apoiado por uma Boehringer Ingelheim Fundação PhD Fellowship. Pesquisas em laboratório R. Benton é financiado por um Conselho Europeu de Investigação Começando Grant pesquisador independente e os suíços National Science Foundation.

1. Assembléia Bloco de Montagem <ol><li> O bloco de montagem plexiglass (Figura 1A) deve ser feita com as especificações exactas dadas no plano (disponível a partir <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Para permitir a fácil montagem e dissecção da mosca. Fio através dos parafusos da parte de trás, mas não se estendem para além da frente do bloco; sua posição irá ser ajustada durante a preparação do animal (ver 2.7). </li><li> Usando uma broca de precisão, fazer um dente na borda superior da câmara circular para a mosca, escavando sob a superfície para dar espaço para o corpo da mosca, a redução da espessura do bloco neste momento. </li><li> Cortado numa grelha de cobre com um bisturi e perpendicular perto do fundo da fenda para criar um &quot;colarinho&quot;. Certifique-se que as duas abas resultantes são de nível, pois isso irá ajudar a inserção da mosca. </li><li> Com um palito, coloque uma pequena gota de supercola para o bloco de montagem acima da câmara circular para a mosca. Coloque a grelha de cobre para a cola e posição de modo que a fenda está centrada sobre o bloco (Figura 1A). Pressione delicadamente e remover qualquer excesso de cola. Com um par de pinças, adicionar pequenas gotas de cola sob as abas de cada lado e dobrar a grade sobre a frente do bloco de modo que a fenda está a apontar para baixo rectas. Assegure-se no topo da grade é nivelada com o bloco. Deixar secar completamente. </li><li> Montar um suporte de fio: corte uma lamela de plástico ao meio e retire uma peça central para fazer um &quot;U&quot;. Use cera para colar um pedaço de arame na parte superior do &quot;U&quot;, não faça o fio muito esticado. </li><li> Construir o escudo da antena: fazer um buraco em uma lamela de plástico com um furador de papel. Aparar as extremidades da lamela para 0,5 x 0,7 cm. Cole a lamela perfurado plástico para fita adesiva e, em seguida, coloque uma gota de álcool na fita exposta pelo buraco pararemover o adesivo. </li></ol> 2. Preparação dos animais <ol><li> As moscas do genótipo adequado - ou seja, tendo a combinação desejada de &quot;driver&quot; e atividade reporter transgenes - deve ser de 1-3 semanas de idade, a cutícula de moscas mais jovens é muito mole e difícil de cortar. Quando as experiências requerem comparação directa de genótipos diferentes, e de modo a corresponder níveis de expressão do transgene, moscas deve ser idade correspondente para evitar relacionadas com a idade diferenças fisiológicas. Se o género não é importante, nós preferimos usar moscas fêmeas uma vez que têm cabeças maiores e são mais fáceis de manipular. </li><li> Anestesiar moscas por arrefecimento em gelo. </li><li> Introduzir uma única mosca no bloco de montagem. Mantenha a mosca pelo conjunto de asa e deslize-, dorsal de superfície em primeiro lugar, ao longo da fenda da grelha de cobre de modo que é suspensa pela seu pescoço (Figura 1B-C). Se necessário, gire-o até que ele está olhando para baixo. </li><li> Colocar uma espinha fina cacto na frente do fly cabeça do para evitar que se escape (Figura 1B C-). Coloque a coluna cacto na frente dos probóscide para evitar que ela se mova. Fixar a coluna cacto para o bloco usando cera de abelha. Assegure-se que a parte superior da cabeça é nivelada com o topo do bloco. </li><li> Fixar a cabeça da mosca para o bloco com uma pequena gota de colofónia (dissolvido em etanol). Colocar o bloco dentro de uma caixa humidificada e permitir que a colofónia para endurecer durante cerca de uma hora. </li><li> Usando uma pinça, puxe a placa da antena para a frente e soltar o fio no suporte (cera lado-out; ver 1.5) na prega cuticular entre a antena ea cabeça. Fixar o suporte para a frente do bloco com cera de abelha. </li><li> Usando os parafusos embutidos no bloco, empurre o suporte do fio para a frente para criar algum espaço entre a placa da antena ea cabeça. </li><li> Coloque a blindagem antenal (ver 1,6) sobre o topo da cabeça da mosca com o furo posicionado centralmente. Fixar com cera de abelha para o início do bloco de montagem. </li><li> Usando uma lâmina divisor, cuta pequeno orifício na fita sobre o escudo expondo a cutícula da cabeça da mosca por trás da antena. O buraco não deve se estender além dos olhos para evitar a elaboração de vazamento. </li><li> Selar o furo entre a fita ea cutícula com dois componentes de silício. Remova qualquer excesso de silício a partir do topo da cabeça da mosca. </li><li> Colocar uma gota de solução salina (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 36 mM de sacarose, 5 mM de HEPES, pH 7,3) na cabeça de Drosophila de Ringer. Certifique-se que não há vazamentos: as antenas devem ficar completamente seco. Usando uma lâmina de safira, cortar um furo na cutícula. Em primeiro lugar, levemente pontuação ao longo da dobra cuticular directamente por trás da antena, em seguida, cortado ao longo dos olhos e em toda a ocelos na parte traseira. Finalmente, dobram o pedaço de cutícula sobre a borda marcados e cortado a partir do lado de baixo para evitar a separar os nervos antenais. </li><li> Retire cuidadosamente as glândulas e traquéia, com uma pinça fina. Lavar repetidamente com Drosophila </em&gt; Ringer, deixando uma grande queda na cabeça. </li></ol> 3. Entrega do estímulo Odor <ol><li> Seringas odor: inserir uma almofada de celulose para uma seringa de plástico de 2 ml com uma pinça limpas e pipeta-o (utilizando pontas de filtro) 20 ul de odor, diluídas conforme desejado num solvente apropriado, usando a ponta da pipeta para empurrar a almofada de fundo no barril . Plug and tampa da seringa até serem necessárias. Diluições de odores frescos devem ser preparados pelo menos a cada 3 meses (ou mais freqüentemente para odores altamente voláteis e / ou muitas vezes utilizado), e as pastilhas novas devem estar preparados para seringas odor pouco antes de cada sessão de gravação. Não use esponjas de odor por mais de três estímulos, uma vez que a concentração de odor pode decair. </li><li> Feito por medida olfactómetro (Figura 2): um fluxo de ar primário (1 l / min) é dirigido através de Teflon tubagem (0,4 mm de diâmetro interno); 27 cm a montante da saída deste tubo, um fluxo de ar secundário (1 l / min ) é adicionado. Ambas as correntes de ar são gerados por bombas de membrana, ea taxa de fluxo é regulada por dois fluxómetros independentes. As correntes de ar podem ser humedecido por passagem através de água em garrafas de gás de lavagem, embora deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de humidificação-(isto é, mais do que ~ 60%). O fluxo de ar secundário é dirigido através de uma seringa de odor ou uma seringa vazia: seringas são ligados ao fluxo de ar através de uma agulha de seringa (1,2 mm de diâmetro exterior) e penetra o êmbolo. Uma válvula de três vias magnético controlado através de uma unidade de controlador de válvula (VC6 Aparelho Harvard, por exemplo) é usado para comutar entre o ar limpo e estímulo do odor. </li></ol> 4. Imagem in vivo <ol><li> Descrevemos aqui imagens usando um microscópio fluorescente na vertical (por exemplo, na vertical fixos Estágio D1 Zeiss Axio Examiner) equipada com uma objetiva de 20x de água (por exemplo Zeiss W &quot;Plano Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (Figura 2). Para imagens com G-CAMP (excitação / emissão: 488/509 nm), use um bloco de filtro com as seguintes propriedades: 450-490 filtro de excitação nm, Dicróica espelho (T495LP) e 500-550 nm filtro de emissão (Chroma ET). Colocar o bloco de montagem contendo a mosca sob o microscópio. Posicionar a saída dos olfatômetro aproximadamente 0,5 cm à frente da antena da mosca. </li><li> Abaixe o objetivo até que toque a solução de Ringer na cabeça da mosca. Olhando através do visualizador sob iluminação de campo brilhante posição, a preparação de modo que o orifício na cápsula cabeça está centrada e suas fronteiras estão em foco. Mudar para luz fluorescente e ajustar o foco até que você possa ver os neurônios marcados (aparente de fluorescência verde basal do G-CAMP). </li><li> Focagem fina glomérulos de interesse através da aquisição de imagens com um dispositivo de carga acoplada (CCD) câmara (por exemplo CoolSNAP-HQ2 sistema de câmera digital) montada no microscópio usando o software de aquisição apropriado (por exemplo Metafluor) (Figura 3A). Feche o diafragma no caminho da luz de iluminação para limitar luz de excitação para a área de imagens. </li><li> Para gravar odor evocadoactividade, ajustar a taxa de aquisição a 4 Hz e ajustar o tempo de exposição para obter valores de fluorescência dentro da gama dinâmica da sua câmara CCD, mas não inferior a 1000 (unidades arbitrárias), com pelo menos resolução de 12 bits dinâmico. O tempo de exposição não deve exceder 100 ms, se possível, para reduzir a G-CAMP fotobranqueamento. Se a resolução espacial da sua câmara permite, é possível aumentar o binning (número de poços no chip que será binned em um pixel digital) para reduzir o tempo de exposição. Nós obter imagens de 350x225 pixels (com um binning de 2x2), correspondentes a 210x135 iM em preparação. Essas configurações são ótimas para capturar o odor glomerulares induzidas pela respostas de G-CAMP, com resolução espacial e temporal, limitando bom repórter de branqueamento. </li><li> Defina os parâmetros de medição. Nós tipicamente gravar durante 10 segundos (ou seja, 40 quadros), com a estimulação odor geralmente a partir de 4 segundos após o início do período de aquisição (quadro 15) e segundo um duradoura (uté quadro 19). Uma preparação de mosca pode normalmente ser testado com até 25-30 estímulos odor diferentes, muitas vezes limitada por uma diminuição irreversível o sinal fluorescente do repórter devido a fotodegradação. O intervalo estímulo inter-dependerá da força da resposta observada ea taxa de fotodegradação. O comprimento adequado de intervalo inter-estímulo para evitar adaptação sensorial pode ser determinada por aproximadamente apresentação repetida de um odor de controlo positivo (se conhecido) em experiências de ensaio. A inclusão deste odor a cada ~ 10 estímulos em uma dada série pode permitir a verificação da viabilidade e capacidade de resposta consistente da preparação. </li></ol> 5. Processamento de Dados e Análise Os dados são processados ​​usando ImageJ (com Mac biofotônica plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) e personalizadas programas escritos em Matlab e R como segue: <ol><li> Corrija para artefatos de movimento da amostra:alinhar todas as imagens correspondentes a uma preparação animal (por exemplo, 30 medidas de 40 frames cada) usando o &quot;corpo rígido&quot; modo de StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ) no ImageJ. Este passo é necessário para remover deslocamentos na posição dos neurónios marcados com respeito à armação aquisição dentro e entre as medições. No entanto, só é possível remover deslocamentos no plano xy. Os dados devem ser descartados se fortes mudanças em foco ocorrer. </li><li> Segmento da pilha em medições individuais de 10 segundos (40-frame). </li><li> Correta para o branqueamento de artefatos: a exposição à luz fluorescente causa fluorescência a decair durante uma única medição 10. Em alguns casos, é importante para corrigir esta decomposição antes de analisar os dados. Para cada medição calcular uma moldura de fundo. Esta deve ser a média de vários quadros antes do início do estímulo (quadros por exemplo, 6-14). Divida cada quadro por este backgarredondar moldura para obter as mudanças relativas de fluorescência. Calcular o valor médio relativo de fluorescência para cada quadro, pela média dos pixels dentro da área marcada por G-cAMP. Ajustar uma exponencial dupla para a curva média de fluorescência, dando mais forte de peso para os quadros antes do estímulo e zero peso com o tempo de resposta do odor (20 quadros após o início do estímulo, no nosso caso). Subtrair o curva ajustada a partir da curva em relação fluorescência de cada pixel. Multiplicar os quadros corrigidos pela armação de fundo para re-obter dados em bruto. Este tipo de correcção pode conduzir a uma modificação na dinâmica de resposta se o sinal não retornar à linha de base até ao final da medição (por exemplo, se inibitórios ou muito forte respostas excitatórias são evocadas) (Figura 4). Enquanto correcção de artefactos de branqueamento é útil em muitos casos, a interpretação de parâmetros temporais deve ser feita com precaução se uma correcção de lixívia é aplicado. </li><li> Calcula-se a alteração relativa na fluorescência (e Delta; F / F) para cada quadro de cada medição, (F i F-0) / F 0 * 100, onde F 0 é o quadro de fundo (ver 5.3), e F i o valor de fluorescência para o quadro ª i de a medição. </li><li> Calcular a média Af / F dentro de uma região circular de interesse numa glomérulo (Figura 3B) com um diâmetro de 10 pixels para obter os vestígios de actividade (Figura 5A). Se desejado, transformar estes vestígios em heatmaps usando ImageJ (Figura 5A). </li><li> Calcula-se a amplitude do pico da resposta subtraindo a média Af / F de quatro quadros antes do estímulo da Af média / F de quatro quadros durante o pico da resposta. O mesmo procedimento é usado tanto para ilustrar os padrões de resposta espacial (ver Figura 3B) e para quantificar a amplitude de resposta em regiões específicas de interesse através moscas (ver Figura 5B). O pico de resposta também pode ser quantificada por integração da área abaixo da curva, durante o tempo do estímulo, ou averaginos quadros g em todo o máximo da resposta. </li></ol> 6. Os resultados representativos Utilizou-se os protocolos acima, para registar e analisar propiónicos respostas ácido evocados de moscas que expressam G-CaMP1.6 28 sob o controlo do promotor para o co-receptor olfativo IR8a, que é activo em várias populações diferentes de ORS 29,30 ( As Figuras 3-5). A estimulação com 1% de ácido propiónico elicia aumentos em G-cAMP fluorescência - indicando aumentos na concentração de cálcio intracelular - em que inervam ORS dois glomérulos, DC4 e DP1l (Figura 3B). Nós ilustram diferentes formas de representação de dados a partir de moscas múltiplas na Figura 5: Vestígios de linha de actividade, Heatmaps e um gráfico de barra de respostas de pico. Respostas propiónico-evocados têm amplitudes de pico distintas e dinâmicas temporais em DC4 e DP1l. Além disso, embora as respostas são geralmente robusta, a variabilidade entre animais individuais também pode ser observada em ambos os glomérulos (ver eleatmaps na Figura 5A). Quantificação das respostas de pico (Figura 5B) permite que um simples comparação estatística entre glomérulos diferentes e diferentes odores através animais. No entanto, odor evocadas respostas de cálcio pode ter não uniformes dinâmica temporal, e quantificar a sua magnitude com um único valor irá desconsiderar essa complexidade. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemático do bloco de montagem (A) antes e (B), após a introdução da mosca, e (C) vista de topo em uma estreita-se (adaptado a partir de 31). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemática do conjunto experimental. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Figura 3. (A) vista de cima da preparação mosca após o passo 2,8 (painel esquerdo) e imagem de fluorescência-prima do antelóbulos NNAL rotulado com G-CaMP1.6 (genótipo: promotor IR8a: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 e DP1l glomérulos podem ser distinguidos pela sua morfologia, tamanho e posição e estão marcadas em vermelho e azul, respectivamente. (B) da imagem com codificação de cores da resposta ao ácido propiónico (1% v / v). A imagem corresponde à Af / F do pico da resposta calculada conforme descrito na etapa 5,6 (ver também Figura 5A). O colorscale à esquerda indica o valor% Af / F. Os círculos negros indicam a posição e tamanho da região de interesse utilizado para quantificar as respostas (ver Figura 5). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Figura 4. Correcção de branqueamento do sinal de repórter fluorescente. Exemplos do efeito de correcção de lixívia como descrito no passo 5,3. Os dados de exemplo no painel esquerdo pode ser corrigido sem grandes mudanças na forma da resposta. Os dados de exemplo no painel da direita é afetar gravementeed por correcção lixívia, provavelmente porque o sinal cai e é mantida abaixo de linha de base após a cessação do estímulo odor. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> A Figura 5 (A) superior:. Dinâmica temporal de respostas de cálcio de glomérulos DC4 (esquerda) e DP1l (direita) para o ácido propiónico (1% v / v). Os traços negros mostram a mediana da Af média / F na região de interesse (ver Figura 3B) em oito animais. A superfície cinza indica o intervalo entre os primeiro e terceiro quartil da distribuição. Apresentação dos valores medianos e quartis fornece mais informações sobre a variabilidade e distribuição de respostas observadas de média e erro padrão. As caixas de verde e magenta indicam os quadros para calcular a média das respostas máximas mostrados na Figura 3B, e quantificado na Figura 5B. Conclusão: os heatmaps mostrar os dados de resposta para todos os animais individuais em linhas separadas, com Af / F valores represented pelo colorscale (extrema direita). As barras horizontais pretas indicam o tempo ea duração do estímulo. (B) A mediana respostas de pico para ácido propiônico em oito animais para DC4 e glomérulos DP1l. As barras de erro indicam o intervalo entre primeiro e terceiro quartil da distribuição.

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Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos de preparação e análise aqui descritos podem ser utilizados para analisar odor-evocados respostas em qualquer população de neurónios no lobo antenal (ORS, LN e PNS) para os quais um transgene condutor correspondente está disponível. Enquanto que descrevem a sua aplicação usando um microscópio de fluorescência, imagiologia óptica desta preparação pode igualmente ser realizada utilizando microscopia confocal ou dois fotões 22,32. Na verdade, estes últimos instrumentos aliviar o problema de dispersão da luz de largura microscopia de campo, que pode reduzir a resolução das imagens, especialmente quando grandes números de neurônios expressam o repórter. Esta preparação permite que geralmente gravações de odor-evocados respostas durante pelo menos meia hora, mas desta vez pode ser significativamente mais longo ou mais curto dependendo do número e comprimento das medições registadas, o tempo de exposição utilizada para cada quadro e do intervalo estímulo-Inter. Além disso, dois fótons excitação pode reduzir fotodegradação do representante fluorescenteorter, bem como fototoxicidade celular, para permitir a medição ao longo de períodos de tempo mais longos 22,32. Independentemente da escolha do microscópio, o movimento do cérebro da mosca dentro da cápsula cabeça é o problema mais recorrente quando imagem em animais intactos. Enquanto movimento de correção pode corrigir pequenos problemas (passo 5.1), normalmente é melhor apenas para gravar a partir de preparações altamente estáveis. Estratégias para reduzir artefatos de movimento incluem: (i) devidamente restringindo a probóscide da mosca com a coluna cacto; (ii) imobilizar pernas da mosca, fixando-lhes o palco com eicosane (antes do passo 2,6) (eicosane pode ser derretido em ~ 37 ° C; utilizar um fio de prata para estender e refinar a ponta do ferro de soldar para este fim), (iii) nicking do esófago (visível entre os nervos antenais) com uma pinça finas. Além disso a G-CaMP1.6 aqui utilizado, um número de versões optimizadas de G-cAMP e indicadores de cálcio estão disponíveis outros,que diferem na sua relação sinal-ruído, a fluorescência basal e dinâmica temporal 12,28,33. A escolha precisa do sensor deve levar em conta todas essas propriedades, o tipo de neurônios a serem analisados ​​ea questão biológica a ser abordado. Sensores de corrente relatam mudanças de cálcio que se correlacionam muito bem com potenciais de ação 12,34, e sua melhoria, juntamente com um número crescente de linhas específicas de driver genéticos 35 vai continuar a aumentar o potencial de imagem óptica da atividade neural na mosca intacta.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornecedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cactus coluna </td><td> Jardim centro </td><td></td><td> ~ 7 milímetros longo fino, nem muito flexível </td></tr><tr><td> Resina </td><td> Loja instrumento de cordas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dois silicone componente </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made bloco plexiglass de montagem </td><td> Plantas disponíveis a partir de <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Grelhas de cobre </td><td> Athene Grids </td><td> G220-5 </td><td> Normalmente utilizado para as amostras de microscopia eletrônica. </td></tr><tr><td> Parafusos </td><td> Loja de ferragens </td&gt; <td></td><td> 2 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> Lamelas de plástico </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> Pontas de ferro de solda </td><td> Conrad Eletrônica </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de alimentação regulada </td><td> Conrad Eletrônica </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Arame fino </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 milímetro </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Zeiss </td><td> D1 Axioexaminer </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Software de aquisição </td></tr><tr><td> Monocromador </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lâminas quebráveis </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte para lâmina </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire lâmina </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> De dois gumes lâmina de 1 mm </td></tr><tr><td> Bombas de membrana de gás </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Safira suporte da lâmina </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Três válvula unidirecional </td><td> Empresa Lee </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuração de E </td></tr><tr><td> Rotâmetro 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotâmetro 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cera de abelha </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Celulose pad </td><td> Kettenbach Medical </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologia # 5 </td></tr><tr><td> Seringas </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2 ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Agulhas </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 milímetros OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

O lobo antenal é o principal centro olfativo no cérebro do inseto e representa o equivalente anatômica e funcional do bulbo olfativo de vertebrados 1-5. Informação olfactiva no mundo exterior é transmitido para o lobo antenal por olfactivos neurónios sensoriais (ORS), que segregam a regiões distintas de neurópilo chamados glomérulos de acordo com o receptor específico olfactivo que exprimem. Aqui, OSN axônios fazem sinapse com os interneurônios locais (LNS), cujos processos podem inervar muitos glomérulos diferentes, e neurônios de projeção (PNS), que transmitem informação olfativa para maiores regiões cerebrais olfativas. Imageamento óptico da atividade de ORS e linfonodos e RdP, no lobo antenal - tradicionalmente utilizando indicadores de cálcio sintéticos (por exemplo, cálcio verde, Fura-2) ou a tensão-sensíveis (por exemplo, corantes RH414) - tem sido uma técnica importante para entender como olfativo estímulos são representados como padrões espaciais e temporaisda atividade glomerular em muitas espécies de insetos 6-10. Desenvolvimento de geneticamente codificados repórteres de actividade neural, tais como os indicadores de cálcio fluorescentes G-cAMP e 11,12 Cameleon 13, o indicador de cálcio bioluminescente GFP-aequorin 14,15, ou um repórter da transmissão sináptica, synapto-pHluorin 16 fez com que o sistema olfativo da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, particularmente acessível a imagem neurofisiológica, complementando seus exaustivamente descritos, propriedades moleculares, eletrofisiológica e neuroanatômica 2,4,17. Estes repórteres podem ser selectivamente expresso através binários sistemas de controlo da transcrição (eg GAL4/UAS 18, LexA / LexAOp 19,20, Q sistema 21) em populações definidas de neurónios no interior do circuito olfactivo para dissecar com resolução espacial e temporal de alta como odor-evocado atividade neural é representado, modulado e transformado 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Aqui descrevemos os métodos de preparação e de análise para medir odor evocadas respostas no lóbulo Drosophila antenal com G-CAMP 25-27. A preparação animal é minimamente invasiva e pode ser adaptado para imagiologia utilizando gama-campo microscópios de fluorescência, confocal e dois fotões.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de vida<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.8K visualizações.  University of Lausanne. Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de vida Drosophila melanogaster.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Neurociência

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Avaliação da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Autor em destaque: uma abordagem inovadora para estimulação elétrica neural usando imagens de cálcio 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...