Agradecemos a Ye Zhang pela ajuda com os traços da amostra e Tin Ki Tsang pela ajuda com as imagens. Este trabalho foi apoiado por um Prêmio de Carreira Antecipada da Fundação Ray Thomas Edwards e uma concessão NIH (R01DC015519) para concessões de C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) para JWW

1. Preparação do hardware para a gravação at4 <ol><li> Use um instrumento de extração de pipeta para preparar eletrodos com capilares de vidro de aluminossilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Destrua ligeiramente a ponta do eletrodo de referência com um par de pinças finas para facilitar a inserção no clypeus da mosca ( ou seja, uma placa arredondada na frente da cabeça da mosca, acima das partes bucais). NOTA: os homens WT de 7 dias de idade (Berlim) foram utilizados neste estudo. Use a solução salina AHL 14 como o eletrólito para ambos os eletrodos. </li><li> Prepare 1 L de AHL através da mistura de 900 ml de água destilada, com 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trealose ּ 2 H 2 O, 3,423 g de sacarose, 1,192 g de HEPES e 8,2 mL de 1 M de MgCl2. Usando água destilada, coloque o volume total até 1 L. Traga o pH para 7,4 usando 1 N de NaOH e esterilize a solução com umSistema de filtro a vácuo. Para armazenamento a longo prazo, mantenha as alíquotas de AHL a 4 ° C. NOTA: Entregas consistentes de ácido palmitoleico dependem da uniformidade entre cartuchos. É fundamental que cada cartucho seja montado de forma reprodutível. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, remova 0,9 cm da ponta de uma dica de pipeta de 200 μL para criar a primeira seção do cartucho, medindo 4,1 cm; Consulte as dimensões detalhadas na Figura 1A . Use outra ponta de pipeta de 200 μL e remova 1,7 cm e 1,5 cm da ponta e da base, respectivamente, para criar a segunda seção de cartucho, medindo 1,8 cm ( Figura 1A ). Use uma régua para garantir a reprodutibilidade. </li><li> Use um perfurador de orifício ⅛ para cortar discos de papel de filtro. </li><li> Use fórceps para colocar um disco de papel de filtro na ponta da segunda seção do cartucho. Confirme visualmente que há uma abertura na ponta do cartucho através da qual o ar pode passar. </li><li> Conecte as seções de cartucho primeiro e segundo juntas, como mostrado na Figura 1A . Aumente a segunda seção do cartucho para baixo para facilitar o apontar quadrado para a preparação ( Figura 1B ). </li><li> Conecte o cartucho com o tubo de fornecimento de odor, que é montado em um micromanipulador. NOTA: Este design permite que o cartucho seja girado para fora para facilitar a troca ( Figura 1C ). </li><li> Defina o fluxo de ar humidificado constante para 2 L / min em um controlador de massa e o fluxo de odorantes para 500 mL / min em outro controlador de massa. </li><li> Usando o software (veja a Tabela de Materiais ), programe o procedimento para administrar um sopro de odor de 500 ms. </li></ol> 2. Preparação de Soluções de Odorante de Ácido Palmitoleico para Entrega NOTA: Or47b ORNs respondem tanto ao ácido cis como ao trans -palmitoleico. Como o ácido palmitoleico é instável em RT, os estoques são armazenados a -20 ° C e utilizados dentro de um mês após a abertura. O etanol é o solvente de escolha para o ácido palmitoleico. <ol><li> Use um misturador de vórtice para misturar completamente 10 μL de estoques de ácido cis- ou trans- palmitoleico ou diluições com 90 μL de etanol a 100% para diluições em série de dez vezes em microtubos de 1,7 mL. Prepare diluições frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de experiências e use em um dia. NOTA: Para os odorantes que não são solúveis em etanol, recomenda-se um frasco de vidro para a preparação de diluições de odor com outros tipos de solventes orgânicos. </li><li> Usando uma micropipeta P10, aplique 5 μL de soluções de ácido cis- palmitolico das diluições desejadas no papel de filtro em cada cartucho correspondente. NOTA: A dose mais alta (10 -1 ) contém 450 μg do composto. Para as soluções de trans- palmititoleico, aplique 4,5 μL em vez disso, de modo que a dosagem mais alta (10 -1 ) também contém 450 μg de tEle compôs. </li><li> Para evaporar completamente o solvente, coloque os cartuchos de ácido palmitoleico em um dessecador de vácuo durante 1 h à RT e 7,59 mmHg de pressão. NOTA: Os cartuchos podem ser usados ​​por até 4 h na RT. </li></ol> 3. Preparação da Drosophila para o Acesso Prático ao At4 Sensilla para Gravação Eletrofisiológica In Vivo NOTA: As moscas WT (Berlim) são criadas em meio de farinha de milho padrão a 25 ° C em um ciclo luz-escuro de 12:12. Após a eclosão, as moscas são separadas por sexo em grupos de dez, pelo que são alojados em grupo até 7 d de idade. Or47b ORNs em moscas masculinas e femininas respondem ao ácido palmitoleico. Por simplicidade, apenas as moscas do sexo masculino são examinadas no estudo atual. <ol><li> Montar um slide de preparação de moscas: em uma lâmina de vidro, coloque uma lamínula de vidro (18 x 18 mm 2 ) em uma pequena quantidade de argila de modelagem, formando um ângulo de ~ 3 ° com a lâmina de vidro. Coloque fita dupla face no interior eDge do lamínula e na área do slide imediatamente abaixo. Substitua por fita fresca por cada dia de gravação ( Figura 2A ). </li><li> Use um aspirador de mosca 15 para coletar a mosca de interesse na tubulação e, em seguida, coloque uma ponta de pipeta de 200 μL sobre o final da tubulação. Simultaneamente, mova o tubo para a frente enquanto sopra ar para dentro do tubo para empurrar a mosca até o final da ponta da pipeta. Use uma lâmina de barbear para cortar logo abaixo do corpo da mosca e 2 cabeças acima da mosca. </li><li> Tampue a parte inferior da ponta da pipeta com argila de modelagem, empurrando a mosca para cima até que as antenas e o clypeus sejam expostos ( Figura 2B ). Para evitar matar a mosca, adicione apenas argila suficiente para expor as antenas e aristae, pois isso evita que o abdômen da mosca seja esmagado. Além disso, adicione argila lentamente e suavemente para evitar qualquer constrição súbita. Confirme se a mosca está viva procurando por antennalOu movimento de probóscis. </li><li> Use fórceps para manobrar a ponta da pipeta que abriga a mosca. Oriente a cabeça de modo que o clypeus esteja virado para a direita do observador. Ajuste a preparação ao longo da lamínula usando fórceps finos até o lado lateral da antena ficar de encontro à superfície do coxiforme gravado ( Figura 2B ). </li><li> Coloque uma haste de retenção no arista para proteger a antena da fita dupla face para evitar o movimento ( Figura 2B ). NOTA: A haste de retenção é puxada de um capilar de vidro de borosilicato com um extrator de pipeta e mantida em posição com argila de modelagem ( Figura 2A ). </li><li> Coloque a preparação no palco da plataforma ( Figura 2C ). Usando o microscópio, confirme que os trichoides são visíveis ao longo da borda distal-lateral do terceiro segmento da antena. NOTA: Idealmente, a sensilla deve ser claramente mostrada em silhueta em segundo plano, o que simplifica a sua<html> Identifica e facilita a gravação ( Figura 3 ). Nesta preparação, a maioria da sensilla trichóide acessível é do tipo at4. </li><li> Mantenha a preparação sob fluxo de ar humidificado constante (2 L / min) entregue através de um tubo de distribuição de ar separado a uma distância de cerca de 2 cm da preparação ( Figura 4 ), conforme descrito anteriormente 2 , 15 . </li></ol> 4. Gravação da atividade de At4 Sensillum a partir de Or47b ORNs nos Trichoids at4 em Resposta ao Ácido Palmitoleico <ol><li> Insira o eletrodo de referência no clypeus ( Figura 3A ). Para evitar danos nos tecidos, assegure-se de que o eletrodo esteja inserido logo abaixo da superfície, onde pode entrar em contato com a hemolinfa sob a cutícula, com um movimento rápido e suave. </li><li> Abaixe o eletrodo de gravação lentamente até que ele entre no mesmo plano de visão que o sensículo alvo (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figura 3B). Gravar sob uma lente objetiva 50X. NOTA: A cutícula tricoide resistente necessita de inserir o eletrodo de gravação na base sensilar, cuja área mais ampla fornece um alvo maior que reduz a probabilidade de o eletrodo ser desviado ( Figura 3B , inserção). </li><li> Antes de aplicar estímulos de odor ao sensilum, observe os seguintes critérios de seleção; Qualquer trichoide que não atinja esses padrões deve ser rejeitado e outro sensilum escolhido em vez disso. <ol><li> Observe uma alta relação sinal-ruído (veja a Figura 3C para um exemplo). </li><li> Observe os picos identificáveis ​​dos neurônios at4A e at4C ( Figura 3C ). NOTA: De notar, a amplitude de espiga at4B parece muito semelhante a at4A 10 e não pode ser facilmente identificada sem estimulação de odor. </li><li> Observe que a taxa de disparo basal dos neurônios at4A éEm torno ou abaixo de 20 Hz. NOTA: Este critério é específico para at4A porque a taxa de disparo basal para o neurônio é maior que a das ORN básicas 2 . Um disparo basal muito maior indica que os neurônios podem ter sido danificados durante a inserção do eletrodo. </li></ol></li><li> Conecte o cartucho ao tubo de entrega de odorantes. Comece com o controle do solvente e depois os odorantes, de baixas a altas concentrações. Use o micromanipulador para manobrar o cartucho em direção à preparação, ao mesmo tempo que apontar o cartucho diretamente na cabeça da preparação. Confirme visualmente que o cartucho é apontado diretamente para a antena ( Figura 4 ) a partir de alguns milímetros de distância. NOTA: O objetivo é orientar a abertura do cartucho diretamente na antena e posicioná-lo próximo ao tecido alvo. </li><li> Certifique-se de que o cartucho odorante esteja separado do eletrodo de gravação à direita por 1 - 2 mm e do pré da moscaP desliza abaixo por aproximadamente 1 mm. NOTA: Na instalação descrita aqui, o cartucho odorante está estreitamente alinhado pelo eletrodo de gravação, o eletrodo de referência e o slide de preparação de moscas ( Figura 4 ). NOTA: Preste atenção na distância entre o cartucho e os eletrodos de gravação / referência. Recomenda-se uma distância de cerca de 4 mm 1 . O contato involuntário pode terminar o sinal e quebrar a ponta do eletrodo de gravação, danificando o neurônio atual e complicando outras gravações. NOTA: Considere a distância que separa o cartucho e o slide de preparação da mosca. Tocar a lamínula também pode desalojar o eletrodo de gravação para interromper a gravação. </li><li> Pressione &quot;Gravar&quot; no software de aquisição de dados para iniciar a gravação. NOTA: Para cada gravação de 10 s, um único pulso de odor de 500 ms é entregue diretamente à antena, conforme descrito no passo 1.9. </li><li> Após aplicação odorante,Retire cuidadosamente o cartucho antes de substituí-lo por um cartucho da próxima concentração mais alta. Continue até que toda a gama de dosagem seja obtida. NOTA: Recomenda-se que apenas um Or47b ORN seja gravado de cada mosca para evitar possíveis efeitos de adaptação. </li><li> Enxaguar completamente o eletrodo de gravação com água destilada depois de terminar a gravação durante o dia. </li><li> Analise e trate os dados usando o software de análise off-line comercialmente disponível. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos um procedimento pelo qual as respostas de Or47b ORNs ao ácido palmitoleico podem ser induzidas e registradas de forma robusta. Modificamos um método convencional de entrega de odor de longa distância 2 , 7 , 10 para solucionar o problema da entrega insuficiente de odorantes de feromonas. Abordamos a questão da baixa volatilidade odorante através da entrega do composto através de cartuchos odorantes, cuja...

<html> As ORN de Drosophila respondem a um grande número de odorantes, com extensões de cadeia de carbono amplamente variadas e uma variedade de grupos funcionais, incluindo ésteres, álcoois, cetonas, lactonas, aldeídos, terpenos, ácidos orgânicos, aminas, compostos de enxofre, heterocíclicos e aromáticos 2 , 3 . Os odorantes variados em suas características físico-químicas podem ter volatilidades marcadamente diferentes, indicadas pela pressão de vapor do composto. Notavelmente, os odorantes biologicamente relevantes para Drosophila melanogaster diferem enormemente em sua volatilidade. Por exemplo, as ORN Ir92a respondem à amônia 4 , que é altamente volátil, com uma pressão de vapor de 6,432 mmHg a 20 ° C. Em contraste, Or67d ORN responde a um feromônio masculino, cis- acetato de vccencenilo ( c VA) 5 , 6 , cuja pressão de vapor é de 43 mmHg a 20 ° C. Ove_content &quot;&gt; Estudar a resposta olfativa a odorantes de baixa volatilidade é particularmente desafiador com os métodos convencionais de entrega de odor, nos quais os odorantes são entregues através de um fluxo de ar transportador sobre uma distância relativamente longa ( ou seja, vários centímetros). Como tal, as respostas olfativas relatadas Para um determinado odorante de baixa volatilidade pode variar muito, dependendo do design do sistema de entrega de odor. Por exemplo, a resposta relatada de Or67d ORNs a uma dose elevada de c VA varia de ~ 40 7 -&gt; 200 picos / s 6 Além disso, a entrega ineficaz de c VA com métodos de entrega convencionais provavelmente é atribuída a resultados falso-negativos, levando à interpretação de que c VA por si só não é suficiente para ativar Or67d ORNs 8. Essa interpretação foi posteriormente desafiada por outro estudo usando um odor método de entrega de curto alcance 9. é, por conseguinte, imperaPara desenvolver um sistema robusto de entrega de odor para a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade. Recentemente, identificamos vários ácidos graxos cuticulares de cadeia longa como ligandos para Or47b ORNs. Eles estão alojados no tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre os odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, descobrimos que o ácido palmitoleico funciona como um feromônio afrodisíaco que promove o namoro masculino ativando Or47b ORNs 1 . No entanto, em outro estudo usando um método de entrega de odor convencional, o laurate de metilo mostrou provocar respostas de Or47b ORNs, enquanto que o ácido palmitoleico não provocou resposta quando apresentado a partir da mesma distância 10 . Em comparação com c VA, os ácidos gordurosos de cadeia longa são ainda menos voláteis, com pressões de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . A baixa volatilidade intrínseca de odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, que impede a apresentação eficiente à antena viaSistemas convencionais de entrega de odor, provavelmente representaram os resultados falso-negativos 10 . Esta inconsistência destaca a inadequação dos sistemas convencionais de entrega de odor na apresentação de odorantes de baixa volatilidade. Foi anteriormente demonstrado que a entrega efetiva de odores cuticulares de mosca requer proximidade próxima entre a fonte de odor e o tecido alvo 6 . Assim, para caracterizar completamente os efeitos das feromonas biologicamente ativas, imitando a distância a partir da qual provavelmente são encontradas pelas moscas da fruta na natureza 12 , 13 , concordamos que a distância mínima deve ser dada prioridade em nosso procedimento. Nosso método possui outras vantagens, incluindo a compatibilidade com plataformas e técnicas de eletrofisiologia padrão. Configurações de plataforma pré-existentes requerem modificações mínimas para acomodar este protocolo, e a maioria das etapas de SSR requerem apenas pequenos ajustes. esteTorna nossa técnica prontamente acessível para pesquisadores experientes em SSR. Além disso, nossa técnica permite a apresentação de odorantes de baixa volatilidade com início e deslocamento nítidos, correlacionando o estímulo com a resposta neuronal. Finalmente, o layout de hardware facilita trocas rápidas entre cartuchos odorantes, agilizando a coleta de dados em uma faixa de dosagem desejada. Começamos por revisar a preparação de eletrodos de referência e de gravação, solução de Hemolinflamadinha Adulto (AHL), cartuchos de entrega de odorantes e o correspondente olfatômetro. Em seguida, discutimos a preparação das soluções de odorantes com ácido palmitoleico, seguido da preparação da mosca para gravação. Continuamos a considerar os critérios para a seleção de um sensil trichoid para registrar e examinar mais de perto o posicionamento do cartucho odorante antes de apresentar dados representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicações úteis desta técnicaAlguns problemas encontrados e suas soluções.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Os insetos dependem do seu odor do sono para orientar uma ampla gama de comportamentos que são críticos para sua sobrevivência, como busca de alimentos, evasão de predadores, oviposição e acasalamento. Muitos produtos químicos de volatilidades variáveis ​​foram identificados como odorantes naturais que ativam os neurônios de receptores olfatórios de insetos (ORNs). No entanto, o estudo das respostas olfativas a odorantes de baixa volatilidade foi dificultado pela incapacidade de apresentar efetivamente tais estímulos usando métodos convencionais de entrega de odor. Aqui, descrevemos um procedimento que permite a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade para a Gravação Single-Sensillum in vivo (SSR). Ao minimizar a distância entre a fonte de odor e o tecido alvo, este método permite a aplicação de odorantes biologicamente salientes, mas até então inacessíveis, incluindo o ácido palmitoleico, um feromônio estimulante com efeito demonstrado sobre ORN envolvidos no namoro e comportamento de acasalamento 1 .Nosso procedimento permite, assim, uma nova via para ensaiar uma série de odorantes de baixa volatilidade para o estudo da olfação de insetos e da comunicação de feromonas.

Nossa técnica foi aplicada com sucesso para determinar a eficácia relativa dos isómeros trans ( Figura 5A ) versus cis ( Figura 5B ) do ácido palmitoleico. Nossos dados representativos demonstram que o ácido trans -palmitoleico é um ligando mais efetivo para Or47b ORNs quando comparado à isoforma cis ( Figura 5C ). Um único neurônio foi registrado de cada...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa.

Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K visualizações.  University of California San Diego.  O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa. 

Vídeo: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologia

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Eletrofisiológica Gravação De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Prove sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Medindo respostas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Imunologia e Infecção

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Único Sensillum gravações para Locust palpo sensilas Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Um novo método para análise aprimorada da atividade dos neurônios gustativos do inseto

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Autor em destaque: Avanços na quimiorrecepção - de receptores de odor de insetos a RNAs não codificantes

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Gravação de base: uma técnica para analisar as respostas dos neurônios gustativos em Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Gravação eletrofisiológica de

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Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Eletrofisiológica Gravação De

Medindo respostas fisiológicas de

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de

Único Sensillum gravações para Locust palpo sensilas Basiconica

Gravação de base: uma técnica para analisar as respostas dos neurônios gustativos em Drosophila