Esta é a primeira vez que um método é desenvolvido para a medição de tempo resolvido dos níveis do transmissor de peptídeos in vivo. Podemos medir os níveis do transmissor de peptídeos em indivíduos únicos e locais discretos com análises quase em tempo real. Primeiro, corte um comprimento de 25 centímetros de fio de platina revestido de perfluoroalkoxy.
Em seguida, usando um bisturi, retire aproximadamente cinco milímetros de revestimento perfluoroalkoxy de uma extremidade, cuidado para não cortar no fio de platina. Agora, insira a extremidade despojada do fio de platina em um pino de conector masculino de um milímetro banhado a ouro. Em seguida, usando alicates de nariz de agulha, amasse os dentes do pino do conector ao redor da extremidade despojada do fio de platina e solde o fio de platina ao pino do conector banhado a ouro.
Em seguida, prepare a solução de dopamina adicionando 50 miligramas de cloridrato de dopamina em 50 mililitros de PBS de 10 milimões com pH seis e misture mexendo. Depois de dissolver completamente a dopamina, coloque a ponta do fio de platina no vaso contendo o PBS recém-feito com suplemento de dopamina. Conecte o eletrodo do disco de cloreto de prata ao canal do solo no estágio da cabeça.
Em seguida, coloque o disco de cloreto de prata no vaso contendo PBS suplementado por dopamina e fio de platina. Antes de prosseguir, conecte um desvio de fio aos canais de referência do estágio da cabeça. Abra o software interativo de aquisição de dados e defina um protocolo potencial de comando de auto-deposição de ponto de serra, definindo o potencial iniciar em menos 0,6 volts, o potencial de final para 0,65 volts, a taxa de varredura em 0,04 volts por segundo e a duração do depoimento para 420 segundos.
Após completar a deposição de polipamina, remova a pelota de cloreto de prata e a ponta do fio de platina do vaso. Coloque a ponta do fio em um microtubo contendo PBS de pH 7.4 por dois a cinco minutos e certifique-se de que a ponta do fio não entre em contato com as laterais ou a parte inferior do microtubo. Em seguida, prepare a solução de anticorpos combinando o anticorpo de interesse com o PBS de pH 7.4 em uma proporção de 1:20 em um vaso de tamanho apropriado.
Em seguida, mergulhe a ponta depositada de polipamina do eletrodo de platina na solução de anticorpos por duas horas à temperatura ambiente, garantindo que a ponta do fio de platina seja suspensa em solução e não repousando na superfície interna do microtubo. Coloque a ponta funcional do imunoprobe capacitivo na câmara de fluxo, tomando cuidado para não perturbar a ponta do eletrodo de forma alguma, pois isso pode danificar a ponta sensorial da sonda. Antes do primeiro teste experimental, realize uma corrida padrão TBS para condicionar a sonda de imunoprobe capacitivo, e para o protocolo de tensão, defina o potencial positivo de passo para 110 milvolts, potencial de passo negativo para menos cinco milivolts, duração da etapa de 20 milissegundos e duração da aquisição para 600 segundos.
Em seguida, crie a solução peptídea de interesse usando o mesmo TBS para manter a composição do superfusato. Configure um sistema múltiplo onde o superfusato pode ser alternado entre TBS e TBS complementados por peptídeos. Use parâmetros padrão TBS e configure o protocolo de aquisição de dados de sensoriamento de peptídeos, definindo a duração da aquisição para 360 segundos.
Antes da deposição de polipamina, rosque a ponta exposta do eletrodo do fio de platina através de uma agulha hipodérmica de calibre 22, deixando aproximadamente dois milímetros além da ponta da agulha. Use fórceps e dobre suavemente a ponta do eletrodo do fio de platina para criar uma farpa que pende da extremidade da agulha hipodérmica. Retire suavemente a agulha da ponta farpada, deixando arame suficiente para colocar no vaso sem que a agulha entre em contato com o fluido e proceda com deposição de dopamina, como demonstrado anteriormente.
Agora, enxágue a ponta da sonda farpada com PBS e coloque-a na solução de anticorpos. Em seguida, remova suavemente a ponta funcionalizada do PBS. Mova a agulha hipodérmica para o imunoprobe capacitivo farpado e implante-a suavemente na região de interesse antes de conectar o pino do conector de ouro no estágio da cabeça.
Uma vez implantado, retire a agulha hipodérmica, deixando o eletrodo no lugar. Um passo positivo no potencial de comando mede a corrente de injeção necessária para fixar a tensão da sonda e permite a medição da corrente capacitiva. O passo potencial de comando negativo limpa o peptídeo ligado do anticorpo através de repulsão eletrostática.
A forma de onda de comando da função passo representava a detecção iterativa e a quantificação do peptídeo. O traço inferior representava o potencial de comando e a corrente resultante sob a superfusão da sonda em TBS. O imunoprobe capacitivo equilibrado mostrou menor decadência inicial e uma linha de base estável ao longo de seis minutos.
O fluxo de neuropeptídeo Y para a câmara de fluxo aumentou as correntes capacitivas sobre a linha de base. As correntes de imunoprobe capacitivas medidas com uma sonda funcionalizada por anticorpos neuropeptídeos Y mostraram um sinal dependente de concentração sensível ao neuropeptídeo de baixo picomole Y Para calibração, uma curva padrão foi medida para todas as concentrações testadas. A estimulação do gânglio estelar bilateral mostrou neuropeptídeo elevado Y quando co-plotado com as correntes capacitivas de controle negativo.
A liberação de norepinefrina medida sob estimulação estelar mostrou uma liberação síncrona com neuropeptídeo Y, consistente com uma resposta simpática evocada. O desenvolvimento dessas técnicas pode fornecer leituras intraoperatórias dos principais moduladores da atividade cardíaca, fornecendo assim uma orientação terapêutica ou intervencional rápida potencial. A técnica aqui apresentada é específica para a implantação cardiovascular, porém, a técnica em si é adequada para outros ambientes fisiológicos, como urina, músculo esquelético, rins, tecido adiposo, etc.
