Este trabalho é suportado por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915; HL088206) e contribuições para o Fundo de Condução Cardíaca do Hospital Infantil de Boston.

Parte 1: Prepare soluções eo sistema de coração isolado perfundido <ol><li> Na manhã do experimento, 4,0 L de Krebs-Henseleit está preparado como descrito anteriormente [5, 6]. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) é dissolvido em 1,0 L de Krebs-Henseleit decantado do perfusato preparada no passo 1.1. </li><li> Um adicional de 150 mL de Krebs-Henseleit é removido do perfusato preparada no passo 1.1 e misturado com 5 Mol / L di-8-ANEPPS (diluído a partir de um estoque 10 mMol / L dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO)). </li><li> Estas três soluções são transferidos para com camisa de água de vidro reservatórios (Radnoti), onde são pré-aquecido a 41,0 ° C e oxigenada com um borbulhador submersa (Radnoti) com 0,2 m filtrada 95% O 2, 5% do gás CO 2. Soluções a partir de 3 reservatórios de ações são bombeados para o sistema de Langendorff parede com Masterflex ™ L / S bombas peristálticas e de baixa absorção de tubo de silicone (Cole-Parmer). </li><li> Antes da montagem, o sistema de Langendorff vidro (Radnoti) é meticulosamente lavados com E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e bem enxaguadas com 0,1 M / L HCl, 100% de etanol, e água destilada. </li><li> O não-recirculação Langendorff aparelho foi construído para entregar 70 mm Hg a pressão constante de 3 reservatórios separados oxigenados, que são separados a partir do coração com bobinas de jaqueta de água de aquecimento e armadilhas bolha (Radnoti) [7]. As 3 linhas de perfusão independente convergem acima do coração, duas torneiras de 3 vias, permitindo-nos controlar com precisão a entrega das soluções preparadas em passos 1,1-1,3. Jaqueta de água de vidro é ligado em série com Masterflex tubulação BPT Pharmed (Cole-Parmer) e aquecida a 39 ° C com água destilada usando dois circuladores E100 (Lauda). Perda de calor através do tubo de silicone de platina curado (Cole-Parmer) que conecta os reservatórios de pressão de cabeça para as bobinas de aquecimento e armadilhas bolha resultou em um 37 ° C perfusato atingindo o coração. </li></ol> Parte 2: Colheita do coração de rato e set-up de perfusão Langendorff <ol><li> Para induzir a anestesia geral profunda em ratos Lewis 200-250 g, 100 mg cetamina / kg e 10 Xilazina mg / kg é injetado na cavidade intraperitoneal. Para esta mistura, acrescentamos 500 Heparina U / kg para evitar a coagulação do sangue e isquemia miocárdica durante o procedimento de remoção. </li><li> Para fácil acesso ao coração e grandes vasos, parede anterior do tórax é removido. Depois disso, o tecido circundante é cuidadosamente dissecados e do saco pericárdico aberto. </li><li> Após a identificação da veia cava inferior, esta embarcação é ligada com seda 5-0 (Ethicon) eo bloco coração-pulmão inteiro é explantado. Tecido é colocado imediatamente em solução gelada Krebs-Henseleit contida em um copo de 50 mL no gelo. </li><li> A aorta ascendente é rapidamente identificado e dissecado do tecido circundante. Uma cânula de tamanho apropriado (Harvard Apparatus) é inserido na aorta, tendo o cuidado de evitar a interrupção da perfusão obrigatória das artérias coronárias através da inserção da cânula muito longe na raiz da aorta. A cânula é fixada à aorta ascendente com seda 5-0 (Ethicon). </li><li> O coração de rato é então colocada sobre o aparelho Langendorff sem a introdução de bolhas de ar na cânula. Perfusão coronária retrógrada vascular é agora estabelecida com a quente, oxigenada solução de Krebs-Henseleit a partir da pressão de cabeça descrito no passo 1.6. </li><li> Tecido extra, incluindo os pulmões, é removido eo coração é perfundidos por 20 minutos para permitir a recuperação da função e estabilizar o ritmo. Durante este tempo, uma sonda de temperatura muito fino termopar (Cole-Parmer) é introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo e suturado no lugar com Prolene 5-0 sutura (Ethicon). A sonda é ligada a um termo-controlador (Digi-Sense) para garantir a temperatura do coração é mantida a 37 ° C, ajustando as configurações das bombas de circulação de água. Movimento de perfusato pingando do ápice cardíaco é minimizado pela colocação de um pedaço de gaze no receptáculo de efluentes. </li></ol> Parte 3: coração de carga com corante potenciométrica e adquirir sinais eletrográficos e óptica <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) é carregado para o coração, alternando para a linha de perfusão que contém a mistura de Krebs-Henseleit com o corante fluorescente usando uma torneira. Além disso, uma cânula de 18G é colocado no átrio esquerdo e / ou para a direita e de 50 mL de solução corante adicional é administrado lentamente em cada uma destas câmaras, porque eles não são suficientemente perfundidos com corante introduzido através das artérias coronárias. </li><li> Durante o procedimento de carga, três derivações (Harvard Apparatus) são delicadamente colocados sobre a superfície do coração que não está enfrentando a ótica utilizada para o mapeamento. Eletrodo N o 1 está posicionado na parte posterior apical do ventrículo esquerdo, o N 2 no átrio esquerdo, e N <su<html> p&gt; O 3 como um eletrodo de referência na raiz da aorta (Figura 1). Os sinais eletrocardiográficos atriais e ventriculares são posteriormente amplificada, digitalizada e exibida ao lado de sinais ópticos usando o software (redshirt Imaging) (Figura 2). Um osciloscópio (Tektronix modelo TDS 1002) também é usado para visualizar a superfície ECG s em tempo real e assegurar a estimulação adequada. </li><li> ECG amplificador (Hugo Sachs Elektronik) configurações: filtro passa-alto: 0,1 Hz Filtro passa-baixa: 150 Hz </li><li> A câmera CMOS (redshirt Imaging) e macroscópio é posicionado usando os ajustes XYZ modo que a superfície do coração está em foco e centrado no quadro de aquisição. A câmara óptica e são montados em uma mesa de isolamento de vibração (Minus K Technology) para minimizar as freqüências de ressonância. Ao mesmo tempo, um eletrodo de marcapasso coaxial (Harvard Apparatus) controlada com um isolado, S48 unidade de estimulação elétrica (Grass), é colocado no átrio direito eo coração está acelerado a 300 batimentos por minuto (Figura 1). </li><li> Estimulação elétrica (Grass) configurações: Taxa: 5 pulsos por segundo Delay: 0,2 ms Duração: 2 ms Volts: 6-12 V Modo: Repetir Pulso: Single </li><li> Para gravações óptico que falta artefatos de movimento de contração, o coração precisa ser desacoplado eletromecânica. Fazemos isso de novo comutação de linhas de perfusão de Krebs-Henseleit solução que contém 11 mmol / L BDM. Entre as aquisições, o coração é puro perfundidos com Krebs-Henseleit para ajudar a preservar a viabilidade da preparação. </li><li> Os parâmetros de gravação são definidos usando o software (Imaging redshirt) com as configurações de aquisição seguintes: Configuração: 2.000 Hz; 128x128 matriz de pixels Intervalo de quadro: 0,5 ms Ganho câmera Amplificador: 5x On-Chip Gain: 8x-12Me bem- Obturador: 500 ms de atraso Número de Frames: 4000 Duração: 2000 ms </li><li> Todas as luzes da sala e equipamentos estão desligados ou blindado para eliminar o ruído de fundo durante a gravação. A luz LED ilumina o coração só durante a gravação óptica para reduzir a foto-branqueamento e toxicidade de corantes. O obturador fonte de luz é controlada com um pulso de 5 V entregue através do painel de controle por meio de uma D-to-Uma placa no computador (Imaging redshirt). </li></ol> Parte 4: Analisar as informações de aquisição utilizando Software Imaging redshirt <ol><li> Após a aquisição, os dados são processados ​​utilizando-se diferentes configurações do filtro. Em geral, usar as configurações padrão, exceto quando se ajusta a Banda Stop / Passe filtro, que é definido com o limite à esquerda em 44,0 e no limite direito a 98,0. Depois as informações gravadas são processados ​​e um filme é gerado (Imaging redshirt). </li><li> Dados de uma aquisição corresponde à ativação local elétrica em 16.384 sites na superfície do coração durante um período de 2 segundos. O software permite que estes sinais locais para ser diretamente comparados entre si e com as gravações atriais e ventriculares eletrográfico. Dados são então visualizados através do mapeamento de ativação elétrica local a cor e tornando esta informação como uma animação mostrando a ativação espaço-temporal elétrica na superfície cardíaca. Para criar tal uma animação, usamos o software para: <ul><li> temporal e / ou filtrar os dados espacialmente </li><li> selecionar um tempo de início e término para a animação </li><li> sinais ópticos para mapa de cores com base na intensidade da luz de descanso de cada pixel </li><li> sobrepor os dados de cor resultante com uma imagem do coração </li><li> gerar a animação </li></ul></li></ol> Parte 5: Os resultados representativos Se a preparação do coração perfundido estava imóvel durante a gravação, o sinais ópticos mostram um pico distinto para cada pixel envolvido em uma mudança da intensidade de emissão de di-8-ANEPPS. Os filmes correspondentes (Figuras 3 e 4) demonstram uma frente de onda de excitação propagação em toda a superfície epicárdica do coração, assim como as gravações simultaneamente adquiridas eletrocardiográfico (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Uma fotografia de uma preparação de coração Langendorff-perfundidos representando as posições do eletrodo de marcapasso em átrio direito e do ECG, como descrito no passo 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2. Representante sinais ópticos e gravações eletrocardiográfico de um coração de rato perfundido Lewis. Um painel mostra uma imagem da superfície epicárdica utilizado para geração de imagens ópticas. A posição dos pixels selecionados para demonstrar as mudanças na emissão de fluorescência ao longo do tempo no Painel B são indicadas por setas coloridas. Sinais eletrográficos são mostrados no painel C com a linha vermelha que indica a ativação atrial ea linha de luz azul correspondente ao sinal ventricular. Por favorve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt; clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use do Hospital Infantil de Boston.

Remoção do coração de ratos anestesiados deve ser realizada rapidamente para evitar a isquemia miocárdica. Se isquemia ou insuficiente perfusão coronária ocorre, o coração provavelmente irá desenvolver arritmias e pode tornar-se infartado. Além disso, esses corações irá mostrar emissão de fluorescência insuficiente para gravações informativo e análises subseqüentes. Antes de colocar o corante, as células do miocárdio têm de ser adequadamente perfundidos com Krebs-Henseleit para estabelecer e mante...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

Mapeamento óptico da superfície cardíaca com sensíveis à voltagem corantes fluorescentes tornou-se uma ferramenta importante para investigar excitação elétrica em modelos experimentais que variam em escala de culturas de células de todo o órgãos<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Usando state-of-the-art sistemas de imagem óptico, geração e propagação de potenciais de ação durante o ritmo cardíaco normal ou durante a iniciação e manutenção de arritmias podem ser visualizadas instantaneamente<sup&gt; [1]</sup&gt;. O mais recente disponível comercialmente sistemas podem fornecer informações em alta resolução espaço-temporal excessivamente e foram baseadas nas custom-built equipamento inicialmente desenvolvido para superar os obstáculos impostos por mais convencionais métodos eletrofisiológicos<sup&gt; [1]</sup&gt;. Avanços em alta resolução e alta velocidade complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) câmeras e intensamente brilhante, diodos emissores de luz (LEDs), bem como corantes sensíveis à voltagem, ótica, e filtros de ter começado a fazer a aquisição do sinal elétrico práticas para biólogos celulares cardiovascular que estão mais acostumados a trabalhar com microscópios. Apesar da nova geração de câmeras CMOS pode adquirir 10.000 frames por segundo em uma matriz de pixels 16.384, dependendo do tipo de preparação das amostras, há muito estabelecido tecnologias de aquisição de fluorescência como matrizes de diodos, sistemas de varredura a laser, e resfriado dispositivo carregado acoplado (CCD câmeras) ainda tem algumas vantagens distintas em relação à gama dinâmica, relação sinal-ruído e eficiência quântica<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. No presente estudo, corações de ratos Lewis foram perfundidos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Com um perfusato cristalóide (Krebs-Henseleit) a 37 ° C em um aparelho de Langendorff modificado. Depois de um período de estabilização de 20 minutos, os corações foram perfundidos com intermitentemente 11 mmol / L monoxime 2,3 butanedione para eliminar a contração associada movimento durante a aquisição da imagem. Para o mapeamento óptico, nós corações carregadas com a sonda de fast-resposta potenciométrica di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) e brevemente iluminada a preparação com 475 ± 15 nm luz de excitação. Durante um período de 2 típicas segundo de iluminação,&gt; luz emitida por 605 nm a preparação cardíaca foi fotografada com uma câmera CMOS de alta velocidade conectado a um macroscópio horizontal. Para esta demonstração, os corações foram passeado a 300 batimentos por minuto com um eletrodo coaxial conectado a uma unidade de estimulação elétrica isolada. Gravações simultâneas bipolar eletrocardiográficos foram adquiridos e analisados ​​juntamente com os sinais de tensão utilizando software prontamente disponíveis. Desta forma, os potenciais de ação sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-pode ser visualizado e registrado com sinais eletrográficos.

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Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K visualizações.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Vídeo: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Componentes principais do microscópio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automático de análise de pulsação óptica de pequenos corações

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.