O protocolo apresenta modelos de Drosophila onde a função cardíaca pode ser caracterizada e controlada usando luz. Isso permite que os pesquisadores estudem doenças cardíacas humanas em Drosophila usando animais intactos. Este método pode alcançar de forma confiável imagens oct não invasivas e controle optogenético da função cardíaca Drosophila.
Tem alta eficiência e qualidade. O ritmo optogenético pode potencialmente ser uma alternativa ao ritmo elétrico como terapia para tratar distúrbios arrítmicos. A imagem oct e o ritmo optogenético podem ser estendidos a outros sistemas modelo, como organoides cardíacos, peixes zebra e garganta e coração embrionários.
Para começar, combine cinco mãos GAL4 sobre TM6 fêmea virgem dupla tubby e duas a três moscas machos de UAS Ops e Stocks por frasco. No dia seguinte, prepare alimentos semi-definidos de acordo com as instruções do Bloomington Drosophila Stock Center adicionando 5,14 gramas por 100 mililitros de sacarose em um recipiente em um prato quente. Em seguida, esfrie-o a 60 graus Celsius com agitação constante.
Em seguida, prepare frascos de moscas estreitos adicionando 50 microlitres de 100 milimães solução de etanol de retina totalmente trans a cada frasco. Use uma pipeta sorológica para descartar cinco mililitros de comida de mosca por mosca estreita vil. Depois de vórtice em velocidade máxima por 10 segundos, conecte esses frascos e enrole-os no tecido escuro para protegê-los da luz.
No dia seguinte, transfira as moscas constantemente colocando ovos para os frascos com etanol de retina totalmente trans contendo alimentos. Proteja os racks com frascos de luz. Após 24 a 48 horas, dependendo do número de ovos colocados, descarte os pais para evitar a superpopulação do frasco.
Em seguida, colete progênere não-tubby para imagem cardíaca. Escolha a opção UAS mão larva GAL4 ou pupa do frasco, coloque-a em um tecido e limpe suavemente a mídia da superfície do corpo usando um pincel de pintura. Prepare o slide do microscópio com um pequeno pedaço de fita dupla face no meio.
Em seguida, coloque suavemente a larva ou pupa na superfície da fita com o lado dorsal para cima e perpendicular ao lado longo do slide usando um pincel ou pinça fina. Aplique pressão suave para prender a larva ou pupa à superfície da fita. Agora, configure o slide no estágio de imagem com a larva ou pupa virada para baixo e ligue a tomografia de coerência óptica ou fonte de luz OCT por software de controle a laser.
Abra o software de controle oct de domínio espectral escrito sob medida. Em seguida, clique na janela de visualização. Em seguida, defina os parâmetros de varredura no software OCT de domínio espectral.
Use micro manipuladores para controlar o estágio amostral para colocar o coração voador em foco. Ajuste a posição focal para minimizar o reflexo da luz da superfície da cutícula da mosca. Além disso, considere aplicar óleo mineral na larva ou superfície de pupa para minimizar o reflexo.
Em seguida, defina os parâmetros de varredura para aquisição de imagem oct do modo M e adquira cinco conjuntos de dados de controle sem pulsos de estimulação da luz vermelha para calcular a frequência cardíaca em repouso. Projete o pulso de luz para a estimulação do ritmo no software de controle de OCT personalizado. Para isso, clique nas guias de configurações e adicione as sequências de pulso de luz projetadas para controlar a frequência de pulso, largura do pulso, duração da estimulação e tempo de espera de acordo com diferentes protocolos de estimulação.
Em seguida, abra o software do controlador de luz para gerar pulsos de luz vermelha. Escolha o modo de pulso na seleção do modo. Clique duas vezes na figura para as configurações do perfil de pulso e escolha o modo seguidor.
Mantenha a intensidade de folga em zero e ajuste a porcentagem de intensidade no cálculo da densidade real de energia. Adquira vídeos de modo M do coração Drosophila batendo com estimulação de luz clicando em Acquire no software OCT Control. Grave flashes de luz vermelha no coração de mosca durante a aquisição de imagens.
Observe que diferentes configurações de ritmo são necessárias para controlar a função de coração de mosca com modelos de moscas com mudanças vermelhas e modelos de mosca NPHR. Abra o software de segmentação de coração de mosca desenvolvido sob medida e clique em arquivo seleto. Em seguida, selecione o arquivo a ser analisado na interface gráfica do usuário.
Insira os limites verticais e horizontais da região do coração em pixels nas caixas de texto superiores. Clique em redimensionar. Usando o controle deslizante na parte inferior, certifique-se de que toda a região do coração esteja visível e que ele preencha toda a caixa para toda a coleção.
Depois de clicar na guia de previsão, o programa passará por cada fatia da coleção e selecionará a região do coração em aproximadamente três minutos. Uma vez concluída a previsão, clique no gráfico de RH para exibir um enredo da área do coração ao longo do tempo em uma nova janela. Selecione as áreas de pico ou vale corretas, escolha o pulso e, em seguida, as guias de RH para gerar uma figura final.
Os parâmetros funcionais serão salvos simultaneamente nos arquivos CSV. A especificidade tecidual do condutor gal4 da mão foi verificada por meio da expressão de proteína fluorescente verde. As imagens típicas de OCT de larval e seção transversal do corpo pupal são mostradas aqui.
Para imitar diferentes condições cardíacas, quatro tipos de pulsos de luz foram projetados. Um único pulso que durou 10 segundos após cinco segundos de espera, gerou prisão cardíaca restauradora. Para o ritmo cardíaco em frequências inferiores à frequência cardíaca em repouso, foram utilizadas duas sequências de pulso leve com frequências de ritmo equivalentes a metade da frequência cardíaca em repouso, e um quarto da frequência cardíaca em repouso que dura oito segundos com um tempo de espera de seis segundos no meio.
O padrão de estimulação para aumentar a frequência cardíaca devido à ativação da canalrhodopsina deslocada avermelhada consistia em três sequências de pulsos de luz. A frequência de contração cardíaca reduzida após os sinais de luz resultou em uma frequência cardíaca mais lenta que imita em larva e pupa. Uma série de três trens de pulso leve em diferentes frequências de estimulação foi aplicada em larvas e corações de pupae mostraram claramente aumento da frequência cardíaca após os pulsos de luz.
A seleção de preparação da prole correta, a montagem da amostra e o procedimento de imagem são essenciais. Esperamos transferir a tecnologia de ritmo optogenético para modelos animais maiores, estudar doenças cardíacas de mamíferos e explorar novas abordagens terapêuticas para tratar a arritmia.
