El protocolo presenta modelos de Drosophila donde la función cardíaca se puede caracterizar y controlar con luz. Esto permite a los investigadores estudiar las enfermedades cardíacas humanas en Drosophila utilizando animales intactos. Este método puede lograr de manera confiable imágenes de OCT no invasivas y control optogenético de la función cardíaca de Drosophila.
Tiene alta eficiencia y calidad. La estimulación optogenética puede ser potencialmente una alternativa a la estimulación eléctrica como terapia para tratar trastornos arrítmicos. Las imágenes de OCT y la estimulación optogenética se pueden extender a otros sistemas modelo como organoides cardíacos, peces cebra y garganta y corazón embrionarios.
Para comenzar, combine cinco manos GAL4 sobre TM6 hembra virgen de doble tubo y dos o tres moscas macho de UAS Ops y Stocks por vial. Al día siguiente, prepare alimentos semidefinidos de acuerdo con las instrucciones del Bloomington Drosophila Stock Center agregando 5.14 gramos por 100 mililitros de sacarosa en un recipiente en un plato caliente. Luego enfríelo a 60 grados centígrados con agitación constante.
A continuación, prepare viales de mosca estrecha agregando 50 microlitros de solución de etanol retiniano todo-trans 100 milimolares a cada vial. Use una pipeta serológica para desechar cinco mililitros de alimento para moscas por vile de mosca estrecha. Después de vortexing a velocidad máxima durante 10 segundos, tapa estos viales y envuélvelos en la tela oscura para protegerlos de la luz.
Al día siguiente, transfiera las moscas que ponen huevos constantemente a los viales con etanol retiniano trans que contiene alimentos. Proteja las rejillas con viales de la luz. Después de 24 a 48 horas, dependiendo del número de huevos puestos, deseche a los padres para evitar la sobrepoblación del vial.
A continuación, recoja la progenie no tubby para obtener imágenes del corazón. Elija la larva o pupa GAL4 del vial, colóquela en un pañuelo desechable y limpie suavemente los medios de la superficie del cuerpo con un pincel. Prepare el portaobjetos del microscopio con un pequeño trozo de cinta adhesiva de doble cara en el centro.
Luego, coloque suavemente la larva o pupa en la superficie de la cinta con el lado dorsal hacia arriba y perpendicular al lado largo del portaobjetos con un cepillo o pinzas finas. Aplique una presión suave para unir la larva o pupa a la superficie de la cinta. Ahora, configure la diapositiva en la etapa de imagen con la larva o pupa hacia abajo y encienda la tomografía de coherencia óptica o la fuente de luz OCT mediante un software de control láser.
Abra el software de control OCT de dominio espectral escrito personalizado. Luego, haga clic en la ventana de vista previa. A continuación, establezca los parámetros de exploración en el software OCT de dominio espectral.
Use micromanipuladores para controlar la etapa de muestra para enfocar el corazón de la mosca. Ajuste la posición focal para minimizar la reflexión de la luz de la superficie de la cutícula de la mosca. Además, considere aplicar aceite mineral en la superficie de la larva o pupa para minimizar la reflexión.
A continuación, establezca los parámetros de escaneo para la adquisición de imágenes OCT en modo M y adquiera cinco conjuntos de datos de control sin pulsos de estimulación de luz roja para calcular la frecuencia cardíaca en reposo. Diseñe el pulso de luz para la estimulación de la estimulación en el software de control OCT personalizado. Para ello, haga clic en las pestañas de configuración y agregue las secuencias de pulso de luz diseñadas para controlar la frecuencia del pulso, el ancho del pulso, la duración de la estimulación y el tiempo de espera de acuerdo con los diferentes protocolos de estimulación.
Luego abra el software del controlador de luz para generar pulsos de luz roja. Elija el modo de pulso en la selección del modo. Haga doble clic en la figura para la configuración del perfil de pulso y elija el modo de seguidor.
Mantenga la intensidad de apagado en cero y establezca el porcentaje de intensidad de encendido al calcular la densidad de potencia real. Adquiera videos en modo M del corazón latiendo de Drosophila con estimulación lumínica haciendo clic en Adquirir en el software OCT Control. Grabe destellos de luz roja en el corazón de la mosca durante la adquisición de imágenes.
Tenga en cuenta que se requieren diferentes configuraciones de estimulación para controlar la función cardíaca de la mosca con canalrodopsina desplazada al rojo y los modelos de mosca NPHR. Abra el software de segmentación de corazón de mosca desarrollado a medida y haga clic en seleccionar archivo. A continuación, seleccione el archivo que desea analizar en la interfaz gráfica de usuario.
Introduzca los límites vertical y horizontal de la región del corazón en píxeles en los cuadros de texto superiores. Haga clic en cambiar tamaño. Usando el control deslizante en la parte inferior, asegúrese de que toda la región del corazón sea visible y que llene toda la caja para toda la colección.
Después de hacer clic en la pestaña de predicción, el programa revisará cada porción de la colección y seleccionará la región del corazón en aproximadamente tres minutos. Una vez que se complete la predicción, haga clic en el gráfico de FC para mostrar un gráfico del área del corazón a lo largo del tiempo en una nueva ventana. Seleccione las áreas correctas de pico o valle, elija las pestañas de pulso y luego HR para generar una cifra final.
Los parámetros funcionales se guardarán simultáneamente en los archivos CSV. La especificidad tisular del controlador GAL4 de la mano se verificó mediante imágenes de la expresión de la proteína fluorescente verde. Las imágenes típicas de OCT de la sección transversal del cuerpo larval y pupal se muestran aquí.
Para imitar diferentes afecciones cardíacas, se diseñaron cuatro tipos de pulsos de luz. Un solo pulso que duró 10 segundos después de cinco segundos de tiempo de espera, generó un paro cardíaco restaurable. Para la estimulación cardíaca a frecuencias inferiores a la frecuencia cardíaca en reposo, se utilizaron dos secuencias de pulsos ligeros con frecuencias de estimulación iguales a la mitad de la frecuencia cardíaca en reposo, y una cuarta parte de la frecuencia cardíaca en reposo que duró ocho segundos con un tiempo de espera de seis segundos intermedios.
El patrón de estimulación para aumentar la frecuencia cardíaca debido a la activación de la canalrodopsina desplazada al rojo consistió en tres secuencias de pulsos de luz. La reducción de la frecuencia de contracción cardíaca después de las señales de luz resultó en una frecuencia cardíaca más lenta que imita en larvas y pupas. Se aplicó una serie de tres trenes de pulsos de luz a diferentes frecuencias de estimulación en larvas y pupas que mostraron claramente un aumento de la frecuencia cardíaca después de los pulsos de luz.
La preparación de la progenie correcta, el montaje de la muestra y el procedimiento de imagen son esenciales. Esperamos transferir la tecnología de estimulación optogenética a modelos animales más grandes, estudiar las enfermedades cardíacas de los mamíferos y explorar nuevos enfoques terapéuticos para tratar la arritmia.
