Este protocolo fornece uma ferramenta única para a geração e isolamento da Clamídia com perfis de desenvolvimento alterados, permitindo, em última análise, a identificação dos genes que regulam o ciclo de desenvolvimento. As principais vantagens deste método são a capacidade de rastrear o desenvolvimento do tipo de célula clamídia em tempo real e a capacidade de isolar a clamídia, com programas de desenvolvimento alterados. Para mutagenizar um repórter clamídia trachomatis, vi um estoque clamídia contendo aproximadamente três vezes o décimo para o sétimo corpo elementar.
Transformado com o plasma de interesse e pelotas do repórter, o pensamento é estocado pela centrúgação. usar sonicação a 10% de potência durante 10 segundos, para resuspensar os corpos elementares em 100 microliters de tampão de metabolismo acidental e dividir a suspensão do corpo elementar resultante igualmente, entre dois tubos de micro centrífugas de 1,5 mililitro. Adicione 50 microliters de solução de metabolismo EMS recém-preparada nas alíquotas de ciclâdia para mutagênese e 50 microliters de tampão de metabolismo vacinal à alíquota de ciclamial apenas para mutagênese de estoque e incubar ambas as amostras por 20 minutos, à temperatura ambiente.
EMS é um conhecido carcinógeno usar luvas durante o manuseio, e absorver todos os equipamentos contaminados em EMS e médio, em um hidróxido de sódio molar por 24 horas antes do descarte. Para criar uma cultura atacadista, para a imagem e isolamento dos trachômetros de clamídia mutigenizada. Semente seis placas de fundo de vidro, com seis vezes 10 a 5 custam sete células, em dois mililitros de médio completo por poço e semente uma placa de poliestireno de 24 poços com 10 a a quinta causa sete células em um mililitro de médio completo por poço.
Para infectar a cultura celular hospedeira com mutagenizados negam a infectação de clamídia, cinco Poços de uma placa de fundo de vidro com aproximadamente seis vezes 10 a 5, de corpos elementares mutagenizados. Em 1,5 mililitros de HBSS frios por poço. e infectar o poço restante, com aproximadamente duas vezes 10 a o quinto simulado de corpos elementares mutagenizados em 1,5 mililitros de HBSS gelado por poço, após uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius, com balanço, lave as células infectadas com 37 graus Celsius HBSS complementados com um miligrama por mililitro de heparina, seguido imediatamente por um hbs de heparina.
lavar as células com heparina novamente, seguida imediatamente por duas enxágues apenas com HBSS para garantir que toda a heparina seja removida. Após a última lavagem, adicione quatro mililitros de 37 graus Celsius de meio de imagem, a cada poço. E preencha os espaços inter-poços com 37 graus Celsius de água desionizada e coloque as placas na incubadora de cultura celular por 10 horas.
No final da incubação, a incubadora do estágio microscópio foi de 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. E coloque a placa de fundo de seis poços de vidro na incubadora de palco. No software de imagem, use o plugin de triagem de alto conteúdo para selecionar o modelo de placa de seis poços e gere uma lista de posição de imagem composta por 12 campos de exibição por bem use a opção de foco automático para definir o foco para a imagem automatizada e definir a exposição a 250 milissegundos com uma intensidade de 4% no canal GFB e uma densidade de 18% no canal RFP.
Assim, no ciclo de imagem por 24 horas, com intervalos de 30 minutos, para capturar a cinética do ciclo de desenvolvimento e definir a captura de imagem para incluir várias pilhas Z com uma gama de foco que termina em ambos os lados da fatia InFocus, em seguida, selecione z relativo para imagem, várias fatias na janela de aquisição e use a opção de pilha de arquivo de imagem. para definir as imagens a serem salvas como arquivos de pilha TIFF. Para identificar faixas de inclusão, com perfis de desenvolvimento alterados, use a célula de importação na tela EMS, o notebook Python de marcação, para importar os dados de faixa de inclusão dos pontos nas estatísticas de faixa, arquivos CSV no quadro de dados do Panda.
Use a célula de cálculo para calcular o tempo para ter expressão máxima para os repórteres precoces e tardios para cada faixa e use o pacote de plotagem bokeh, na célula de enredo meio máximo, para visualizar o tempo de duas meia expressão máxima para meia expressão máxima contra a do baile hctB. Use a faixa interativa bokeh ID Explorer, para identificar inclusões da população mutante, que caem fora da nuvem de dispersão tratada simulada. Para visualizar mudanças na expressão do promotor cinética dinamicamente no gráfico de células sanguíneas animadas as intensidades de expressão do baile EOU contra o baile hctB.
Em seguida, visualize um instantâneo do gráfico animado, na célula localizadora de inclusão. Para isolar os Newtons desenvolvimentante, a partir das inclusões de interesse, posicione o campo de visão sobre um poço com inclusão identificada, e passe a agulha sobre a interferência diferencial de fase contraste fonte de luz do canal de luz branca, para visualizar a agulha, use o nanômetro de 595, canal de excitação, para visualizar os corpos elementares para extração. E use o ajuste fino e o micro manipulador, para manobrar a agulha capilar até a inclusão, romper a inclusão com a agulha, e usar o micro injetor para atrair os corpos elementares para a ponta da agulha capilar.
Expulse os corpos elementares extraídos, da agulha capilar em um único poço, do preparado a 24 placas de poliestireno, e use uma nova agulha capilar para a próxima extração. Após uma expansão suficiente de cada isolado, interrompa a monocamada infectada com uma ponta de micropipet de um mililitro e transfira os detritos celulares médios e liberou a clamídia em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Pelota a clamídia colhida por centrifugação, e resuspenda a pelota em 75 microlitros de gelo frio, tampão de glutamato de sacarose, em seguida, dividir a suspensão de inclusão igualmente, entre três novos tubos de micro centrífugas de tampa de parafuso de 1,5 mililitro, e armazenar os tubos a menos 80 para ler Celsius.
Para configurar uma cultura de célula hospedeira para a imagem de mutagen ISED isola uma placa inferior de vidro de 96 poços com 1,6 vezes 10 a 10 a 4 custam sete células, em 100 microliters de meio completo por poço. Depois que a monocamada de células hospedeiras atinge a confluência descongelar os clones mutantes colhidos e os estoques de clamídia silvestre no gelo e usar uma coluna por isolante para realizar, uma diluição serial de cada mutante isolado. Infectar, a coluna restante com clamídia de tipo selvagem, com uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 0,5, e colocar uma placa na incubadora de cultura celular por 10 horas no final da incubação, selecionar três poços por isolado mutante que correspondem a uma multiplicidade de infecção de menos de um, e gerar uma lista de posição de imagem.
consistindo de dois campos de visão por bem. Neste dispersão, o tempo para a expressão metade máxima dos promotores do EOU e do HCTB de isolados de clamídia individuais pode ser observado clones A3667 e B3858 foi eleito para isolamento, pois produziram tempos mais curtos para ter expressão máxima, do promotor do EOU e quatro vezes mais quatro hctB. Inclusões com cinética alterada podem ser identificadas com base na visualização, na expressão genética dinâmica dos dois promotores, e um instantâneo do gráfico animado pode ser usado, para identificar a localização das inclusões de interesse.
Nessas visualizações representativas, foram identificadas 24 inclusões para isolamento, sendo 10 apresentaram cinética diferencial, após o reteste em três diferentes categorias fenotípicas, oito isolados apresentaram diminuição da expressão do promotor de EOU em aproximadamente 24 horas após a infecção. Como demonstrado pelo clone A3667, o isolado B3858, também apresentou uma expressão de promotor de EOU reduzida, em cerca de 24 horas após a infecção. Mas um aumento global na expressão do promotor do HCTB, enquanto o isolado B3662, expressou níveis aumentados de floresnce floresce do promotor do EOU seguido por uma súbita perda de expressão em ambos os promotores.
A análise dos micrografos de células vivas para mutantes B3662, revela que a lise celular hospedeira ocorreu, em células infectadas por esse mutante, muito antes do que em células infectadas do tipo selvagem. O desenvolvimento de tipo celular deficiente na recuperação da clamídia pode não ser possível, pois essas células não podem reinfectar o hospedeiro. Estudos de associação de genomas amplos podem ser utilizados após o isolamento, para identificar genes de desenvolvimento, por meio de correlação estatística, com a incorporação de repórteres promotores alternativos.
Este método pode ser estendido, à sondagem de numerosas vias genéticas, na dissecção de mecanismos de circuito genético, e outros patógenos intracelulares.
