Este trabalho foi financiado pela Agence Nationale pour la Recherche e pelo Conselho Europeu de Investigação.

O teste funciona em vários formatos, porém recomendamos da redução do volume da amostra para salvar os reagentes, especialmente CCF4-AM. Portanto, o protocolo seguinte é descrito para as células HeLa fixos ou células THP-1, macrófagos, como num formato de 96 poços, em seguida, para as células HeLa vivas em pratos de vidro de fundo 35 mm. O ensaio pode ser adaptado a outros agentes patogénicos. Além da infecção Shigella, descrevemos o ensaio para THP-1 fagocitando diferentes m y cepas cobacterial. Importante, após CCF4-AM carregamento, todos os reagentes e tampões, incluindo tampões de lavagem requerem a presença de probenecid em 1 mM. A probenecida é um inibidor do canal do anião que promove a retenção de citosólica CCF4 longo de todos os passos do protocolo. As amostras devem ser fixos adquirida dentro de algumas horas após a experiência, desde o sinal de CCF4 não é estável durante períodos de tempo longos. 1. CCF4 Ensaio em amostras fixadas com Shigella flexneri (placas de 96 poços) <ol><li> Preparando-se para culturas de bactérias durante a noite. Inocular os pré-culturas bacterianas do tipo selvagem (M90T AFAI) e mutantes (BS176 AFAI) estirpes 1 dia antes da infecção em 8 ml de caldo de soja tríptica de caseína (TCSB) suplementado com ampicilina (50 ug / ml) num agitador a 37 ° C durante a noite . </li><li> Células chapeamento de infecção. As células HeLa semente em placas de 96 poços um dia antes da infecção, com uma densidade de 5 x 10 3 culas por po em meio DMEM contendo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS) e 1% de penicilina-estreptomicina numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora num volume final de 100 ul. No caso de células THP-1, macrófagos, como, chapeamento de célula é feito 2 dias antes da infecção, a uma densidade de 5 x 4 10 células / poço, e são incubadas com 30 nM de acetato de forbol miristato (PMA) em meio RPMI contendo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol. </li><li> Preparando-se para as bactérias subcultura. Inocular culturas bacterianas durante a noitea uma diluição de 1/100 em TCSB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina num agitador a 37 ° C durante 2,5 horas (OD600 = 0,3 a 0,4). </li><li> Carregar pilhas com CCF4-AM. Preparar a mistura de CCF4-AM carregamento para um volume final de 25 ul por poço contendo probenecid 1 mM (Sigma), 1,5 jaM CCF4-AM (6 uM, no caso de células THP-1) e 1,25 mL de carga de solução B (100 mg / ml surfactante Pluronic-F127 em ácido acético DMSO/0.1% proporcionado ao longo CCF4-AM LiveBlazer carregando Kit pela Invitrogen) em EM tampão (120 mM de NaCl, 7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM de glicose, HEPES 25 mM a pH 7,3). Lave as células uma vez com PBS e adicionar 25 ul de CCF4-AM carregamento mistura por cavidade à temperatura ambiente no escuro durante 2,5 horas. </li><li> Preparando-se para a infecção por bactérias. Rotação 1 ml de subculturas bacterianas a 9.000 rpm durante 1 min. Lavar uma vez com 500 ul de PBS, centrifugação a 9.000 rpm durante 1 min e ressuspender em 500 de PBS suplementado com 10 ug / ml de poli-L-lisina (Sigma) e 40 ng / ml β-lactamase (Sigma). Após 10 minutos de incubação numa roda rotativa à temperatura ambiente, lavar uma vez com 500 ul de PBS e as bactérias ressuspender em 500 ul de tampão de EM / 1 mM de probenecida. </li><li> Infecção celular e fixação. Lave as células uma vez com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida, preparar uma mistura de 10 uL de bactérias foram ressuspensas num volume final de 100 ul de tampão de EM / 1 mM de probenecida e distribuí-lo a cada poço. Após 15 minutos de incubação no escuro à temperatura ambiente, a placa de exibir até 37 ° C durante 1 hora (90 minutos, no caso de células THP-1), lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida e fixar com 50 uL de paraformaldeído 4% / 1 mM de probenecid durante 10 minutos no escuro. Em seguida, lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida, incubar durante 30 minutos com 30 ul de 10 mM núcleos corante DRAQ5 (Biostatus), lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida e deixar as amostras em 100 ul de PBS / 1 mM de probenecida. </li><li> Configurações de aquisição de amostras fixas. A aquisição é realizada utilizando (i) um invertido micros epifluorescêncialidar com um 20x (0,5 Abertura numérica (NA), 2,1 Distância de trabalho (WD)) ou 40x (0,75 NA, 0,72 WD) objetiva ar N-Plano ou (ii) usando um microscópio confocal com uma objetiva de 10x. Fluorescência de imagem é realizada com excitação a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) e detectada por meio de emissão de 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) e 535 nm (filtros Semrock, FF01-520/35- 25), utilizando tempos de exposição de 5 ms (luz transmitida), 1.000 ms (535 nm) e 500 ms (450 nm). Imagiologia confocal é realizada utilizando o seguinte tempo de exposição: 240 mseg (450 nm) e de 360 ​​mseg (535 nm) para o laser de 405 nm (870 μW), 640 mseg (DRAQ5) para o laser de 640 nm (2560 μW). </li><li> Análise pós-aquisição. Posteriormente, as imagens são analisados ​​por um algoritmo de computador que permite marcar automatizado do sinal de fluorescência para cada células individuais. Programas tais como Metamorph 7.1 ou Acapella pode ser usado para criar um script para medir a proporção entre os sinais de emissão de 450nm e 535nm (disponível a pedido). De notar que o uso de um dispositivo de calibração de focagem acoplado a microscopia durante a aquisição automatizada permite a aquisição de dezenas de diferentes posições em múltiplos poços ao mesmo tempo. </li></ol> 2. CCF4 Ensaio sobre amostras ao vivo usando Shigella flexneri (35 milímetros Formato de vidro de fundo, MatTek) <ol><li> Preparando-se para culturas de bactérias durante a noite. Proceder como descrito anteriormente. </li><li> Células chapeamento de infecção. As células HeLa semente de vidro em placas de cultura de 35 mm de fundo (MatTek 10 milímetros de micropoços, MatTek corporação) um dia antes da infecção, com uma densidade de 2 x 10 5 células / placa num volume final de 2 ml. </li><li> Preparando-se para as bactérias subcultura. Proceder como descrito anteriormente. </li><li> Carregar pilhas com CCF4-AM. Preparar a mistura de carga de CCF-AM conforme anteriormente descrito para um volume final de 2 ml por prato. Antes do carregamento, lavagem das células uma vez com PBS. </li><li> Preparando-se para a infecção por bactérias. Proceder como descrito anteriormente. </li><li> Acquisitconfigurações de iões de amostras vivas. A aquisição é realizada durante 60 min a cada 90 segundos com um microscópio de epifluorescência invertido usando uma 20x (0,5 NA, 2,1 DT) ou de uma objectiva de 40x de ar N-Plano (0,75 NA, 0,72 WD) ° C dentro de uma câmara de aquecimento 37. Fluorescência de imagem é realizada com excitação a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) e detectada por meio de emissão de 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) e 535 nm (filtros Semrock, FF01-520/35- 25), utilizando tempos de exposição de 5 ms (luz transmitida), 200 ms (535 nm) e 100 ms (450 nm). </li><li> Infecção celular e aquisição vivo. Lave as células uma vez com 2 ml de PBS / 1 mM de probenecida, adicionar 2 ml de EM / 1 mM de probenecida, montar o prato no estágio do microscópio e iniciar a aquisição. Após 6 min (ponto 4 do tempo), coloque a aquisição em espera, adicionar 250 ml de bactérias ressuspensão em cima das células e reiniciar a aquisição. </li><li> Análise pós-aquisição. Os filmes podem ser visualizados usando Metamorph ou ImageJ. 450/535 nm rácios de intensidade para cada indivíduocélula dupla pode ser obtido utilizando o ImageJ. Como mencionado anteriormente, a utilização de um dispositivo de calibração de focagem acoplado a microscopia durante a aquisição automatizada permite a aquisição de várias posições diferentes, dependendo do intervalo de tempo. </li></ol> 3. CCF4 Ensaio em amostras fixadas com Micobactérias (96 Formato Well) <ol><li> Preparação das bactérias. Crescer cepas de micobactérias a fase mid-log em 7H9 contendo dextrose albumina catalase (ADC) a 30 ° C (para Mycobacterium marinum) ou 37 ° C (por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Células chapeamento de infecção. Placa de THP-1 macrófagos dois dias antes da infecção incubando-os com 30 nM de PMA, em meio RPMI contendo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol numa atmosfera de 5% incubadora de CO 2, num volume final de 100 ul a uma densidade de 5 x 4 10 células / poço. </li><li> Preparando-se para a infecção por bactérias. Harvculturas est, lavar e ressuspender com PBS antes da sonicação e filtração através de uma seringa, a fim de evitar aglomeração. Determinar a concentração de cada estirpe por medição de OD600 e infectar células THP-1 a um MOI de 1:01 a 30 ° C (para Mycobacterium marinum) ou 37 ° C (por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis) em meio RPMI com 5% CO 2. Após 2 h, remova o meio, lavar 3 vezes com PBS e adicionar meio fresco completo por 1 a 2 dias (no caso de Mycobacterium marinum) ou 3-7 dias (no caso de Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Células com CCF4-AM e fixação de carga. Lave as células uma vez com PBS e preparam a mistura AM CCF4-carregamento, como descrito anteriormente, para um volume final de 25 ul por poço usando um CCF4-AM concentração final de 6 mM. Carregando tem lugar à temperatura ambiente no escuro durante 2 horas antes de se lavar com 150 ul probenecida PBS / 1 mM e corrigirção com 50 uL de paraformaldeído a 4% suplementado with1 mM de probenecid durante 30 minutos no escuro. Em seguida, lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida e deixar as amostras em 100 ul de PBS / 1 mM de probenecida. </li><li> Configurações de aquisição e análise de pós-aquisição. Proceder como anteriormente descrito no primeiro parágrafo com Shigella flexneri. </li></ol> Protocolo Suplementar Os ensaios são realizados fluorimétrica, a fim de verificar a actividade β-lactamase na superfície das bactérias. Isto deve ser feito para cada estirpe bacteriana destinada a ser utilizada no ensaio descrito. Para este efeito, as bactérias são lavadas posto em contacto com 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml de esterase de fígado porcino extractos (Sigma) em 1 ml de PBS durante 1 hora a 37 ° C no escuro. Solúvel lactamase 1 mg / ml (Invitrogen), pode ser usado como um controlo positivo. Em seguida, uma verificação é feita de emissão com excitação a 405 nm usando um PTI Quantamaster fluorímetro e um 1 ml de quartz cuvete. A perda de FRET a 535 nm, e o aparecimento de um pico alto de 450 nm, são visualizados sobre bactérias adição à sonda CCF4.

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Não temos nada a divulgar.

O ensaio CCF4-AM/β-lactamase é um método simples para controlar perturbações vacuolar intracelular induzida por Shigella flexneri e micobactérias em diferentes tipos de células. Ele faz uso de um citoplasmática sensível FRET repórter lactamase que é clivada por uma enzima activa na superfície das bactérias. A perda do substrato CCF4-AM podem ser facilmente evitados por adição de probenecida para todas as soluções, após o carregamento do substrato. Tal como demonstrado, o ensaio pode ser adaptado para vários tipos de células (células epiteliais, células fagocíticas) e formatos (96 poços, 35 pratos de vidro de fundo mm, 6/12/24 placas de poços). Para a utilização da placa de 6/12/24, lamelas estéreis são distribuídos na parte inferior de cada poço antes de semear as células. No fim do experimento, lamelas são transferidos em lâminas em meio de montagem, tal como prolongar Reagente Antifade Gold (Invitrogen). Desta forma, o sinal é estável durante períodos de tempo mais longos, após testeem comparação com o formato de 96 cavidades em que as amostras são mantidas em PBS após a fixação. O elevado custo do substrato CCF4-AM devem ser tidos em conta antes da determinação do volume da amostra. É por isso que recomendamos a dimensioná-las para baixo. As experiências são mais caros em 6/12/24 formato bem, mas os sinais são estáveis ​​durante vários dias. Pelo contrário, as experiências são mais baratas no formato de 96 poços, mas as amostras têm de ser analisados ​​no dia da experiência. É de salientar que as experiências vivo também pode ser realizada a 96 a 384 ou formato bem bem. Isto permite a realização de experiências vivo usando dezenas de condições, ao mesmo tempo (bactérias mutantes, Moi, transfecção de plasmídeo ou siRNA, produtos químicos, etc) com o número de posições por poço. Embora adequado para Shigella flexneri, destacamos que &quot;verdadeiro&quot; tempo real ou experiências de lapso de tempo não são viáveis ​​para estudos de micobactérias desde que o ciclo de infecção ultrapassa concentrações mensuráveis ​​de CCF4 que podem ser retidos no citoplasma. Paraesta razão, o substrato CCF4-AM é aplicada apenas sobre as células é conseguido após a invasão. No caso de software MetaMorph é utilizado para a aquisição e análise, recomendamos a utilização do módulo de &quot;aquisição screen&quot;, que permite a aquisição de todo um 96/384 com placa de um determinado número de imagens por bem. Além disso, os dados da tela &quot;avaliação&quot; do módulo permite que (i) a visualização da imagem em mosaico costurado de cada bem para qualquer canal ao mesmo tempo em um grande &quot;poster&quot; e (ii) looping um algoritmo especializado para medir as intensidades no 535 e os canais 450 nm. Mesmo assim, temos sido capazes de medir ruptura vacuolar por bactérias isoladas usando microscopia de lapso de tempo, gostaríamos de advertir que a atividade enzimática na superfície de bactérias individuais varia tornando-o difícil de correlacionar com precisão o número de bactérias e efetividade das vacuolar intracelulares ruptura. Dada a robustez do ensaio, que é adequado para hrendimento igh se aproxima em 96 ou 384 formatos também. Também este protocolo adaptado com sucesso para a análise de FACS para o estudo da infecção de células em suspensão 16. O ensaio também pode ser utilizado para a investigação de outras bactérias ou transportadores que apresentam lactamase na sua superfície, o que conduz a uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, esta abordagem pode ser utilizada para estudar vacuolar ruptura induzida por outros agentes patogénicos, tais como β-lactamase expressa Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium 12. Desde Listeria monocytogenes tem um curto ciclo de infecção comparável a Shigella flexneri, as experiências de lapso de tempo são possíveis. Em contraste, porque Legionella pneumophila e Salmonella typhimurium exibição longos ciclos de infecção, sugerimos a realização de experimentos ponto final. A variedade de aplicações possíveis torna o ensaio de uma CCF4-AM/β-lactamasemétodo fluorimétrico interessante para acompanhar ruptura vacuolar induzida por patógenos intracelulares em amostras fixas ou em tempo real.

Numerosas bactérias patogênicas são internalizados em compartimentos por membranas de células eucarióticas durante o curso da infecção. Entrada de célula ocorre através de fagocitose por células hospedeiras especializados, como é o caso para o Mycobacterium tuberculosis, que são ingeridas por macrófagos, ou os patógenos induzir activamente a sua absorção em células normalmente não fagocíticas. No caso da absorção de induzido, por exemplo, para a Shigella flexneri, o patógeno injecta proteínas efectoras para o citosol de acolhimento que sequestram entre outras funções celulares do endomembranar máquinas triagem firmemente regulado resultando em localização bacteriana dentro de um compartimento endossomal 1,2. Subsequentemente, Shigella rompe a membrana envolvente que leva à ruptura vacuolar e acesso citosólica do patógeno interferir com o tráfico de membrana de acolhimento e evitar a entrega ao lisossoma. Mais recentemente, a ruptura phagolysosomal também foi encontrado como str infecçãoategy usado por Mycobacterium tuberculosis, um agente patogénico que foi pensado por um longo período de tempo a ser exclusivamente localizada dentro de um compartimento ligado à membrana 3,17. Para investigar a dinâmica do tráfico de membrana subcelular de patógenos invasores, grandes avanços têm sido realizados desde a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos sobre o final de 1980 de 4,5 base. Por exemplo, os métodos baseados em microscopia de fluorescência utilizando corantes, os anticorpos contra os componentes da superfície bacteriana, ou marcadores para a co-localização com compartimentos subcelulares assumiu 6,7. No entanto, eles ainda não deu resolução espaço-temporal preciso e robustez para medir ruptura vacuolar por patógenos bacterianos quantitativamente. Este obstáculo foi tratada com um ensaio baseado no repórter derivado CCF4-AM FRET cefalosporina, que foi usado pela primeira vez para estudar a expressão do gene 8. Em seguida, utilizou-se no contexto da infbiologia exão para investigar secreção efetoras e acompanhar a captação de Neisseria em células hospedeiras 9,10,11. Nós desenvolvemos um ensaio aproveitando este repórter para estudar ruptura vacuolar induzida por Shigella flexneri 12 e Mycobacterium tuberculosis 17. O princípio do método é o descrito na Figura 1, usando a Shigella flexneri. Em primeiro lugar, as células hospedeiras são carregados com o traste substrato CCF4-AM que está preso no interior do citoplasma, depois cortando fora os PM metades éster. Em seguida, as células são infectadas com Shigella flexneri. β-lactamase presente na superfície da bactéria é capaz de clivar o substrato CCF4 logo que ocorre a ruptura vacuolar. Isto leva a uma perda de FRET sinal de comutação do pico de emissão de 535 nm a 450 nm, após excitação da sonda a 405 nm. A medição radiométrica das intensidades 450/535 nm destaca integridade vacuolar: baixos índices refletem membrana-enbactérias fechados ou extracelular, enquanto que altas taxas de refletir contato entre as bactérias eo citosol host. Nós também relatam uma adaptação do método para o estudo de ruptura phagosomal induzida por Mycobacterium tuberculosis em macrófagos THP-1. Os princípios experimentais permanecem os mesmos, embora a sequência é invertida, CCF4-AM carga é aplicada apenas após a infecção bacteriana. Assim, por meio de medições de fluorescência raciométrica quantitativas ao nível de uma única célula, a ruptura vacuolar da Shigella flexneri pode ser monitorado em tempo real e em amostras fixadas de diferentes tipos de células 12,13,14. Além disso, este método pode ser adaptado a um certo número de outros agentes patogénicos invasivos, como mostrado neste estudo, utilizando Mycobacterium bovis e Mycobacterium tuberculosis. Finalmente, a miniaturização do nosso protocolo de 96 poços (ou 384 poços) formatos permite a exibição de inúmeras doenças de alto rendimento.

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		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1089</td>
			<td>Protect from light, stock in - 80 &deg; aliquots</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Draq5</td>
			<td>Biostatus</td>
			<td>DR50050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&mu;CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-lactamase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0389</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens

Shigella flexneri são bactérias patogênicas que invadem células hospedeiras que entram em um vacúolo endocytic. Subsequentemente, a ruptura de membrana deste compartimento fechado permite que as bactérias para se deslocar dentro do citossol, proliferar e invadir mais células vizinhas. Mycobacterium tuberculosis é fagocitado por células do sistema imune, e, recentemente, tem sido demonstrado que a ruptura da membrana phagosomal em macrófagos. Nós desenvolvemos um teste robusto para rastreamento ruptura da membrana phagosomal após a entrada de Shigella flexneri ou Mycobacterium tuberculosis célula hospedeira. A abordagem faz uso de CCF4, um repórter sensível a FRET β-lactamase que se equilibra no citosol das células do hospedeiro. Após a invasão das células do hospedeiro por patogénios bacterianos, a sonda permanece intacta enquanto as bactérias residem em compartimentos por membranas. Após interrupção da, actividade β-lactamase vacúolo na superfície dos organismos patogénicos intracelulares cliva CCF4 instantaneamente levarção a uma perda de FRET sinal de comutação e o seu espectro de emissão. Este ensaio radiométrico robusta produz informação precisa sobre o momento de ruptura vacuolar induzido pelas bactérias invasoras, e pode ser acoplado a microscopia automatizado e de processamento de imagem por meio de algoritmos especializados para a detecção dos sinais de emissão do dador e aceitador de FRET. Além disso, permite investigar a dinâmica de ruptura vacuolar provocada por bactérias intracelulares, em tempo real, em células individuais. Finalmente, é perfeitamente adequado para a análise de alto rendimento com uma resolução espaço-temporal superior a métodos anteriores. Aqui, nós fornecemos os detalhes experimentais de protocolos de exemplares para o vacuolar ensaio CCF4 ruptura em células HeLa e THP-1 macrófagos para experimentos de lapso de tempo ou pontos finais experimentos usando Shigella flexneri, bem como várias cepas de micobactérias, como Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, e Mycobacterium tuberculosis.

A abordagem CCF4-AM/β-lactamase é um método robusto e sensíveis para rastrear ruptura vacuolar de agentes patogénicos intracelulares, tais como Shigella flexneri (Figura 1). As estirpes de Shigella que são usados ​​neste estudo são denominados M90T AFAI e BS176 AFAI. M90T AFAI é uma estirpe de Shigella flexneri que expressa a adesina AfaE, que é capaz de se ligar de forma eficiente o CD55 na superfície das células epiteliais 15. Estirpes que expressam Portanto AfaE exibir capacidades muito mais elevadas invasão comparado com a estirpe de tipo selvagem M90T em células epiteliais. BS176 AFAI é um mutante que expressa AfaE Shigella flexneri estirpe desprovida do plasmídeo de virulência Shigella. Esta estirpe é capaz de invadir células HeLa. No entanto, esta estirpe é capaz de entrar nas células THP-1 uma vez que a absorção nesta linha celular de contar apenas com a fagocitose clássica e não necessita de um sistema de secreção de tipo-3 funcional. Ambas as estirpes expressam β-lactamaseE exibir actividade β-lactamase na sua superfície, devido à presença do plasmídeo de codificação AfaE. Após a infecção de células HeLa com o não-invasiva BS176 AFAI tensão durante 1 hora, a FRET CCF4 sonda permanece intacta, conforme mostrado na Figura 2A através do sinal verde (535 nm). Pelo contrário, a infecção com a estirpe M90T AFAI virulenta, durante 1 hora leva a um comutador de sinal para o azul (450 nm), com destaque para a clivagem da sonda no citosol. Para quantificar isto, nós desenvolvemos um script para o software Metamorph Acapella e que permite a detecção automática de células e a medição das intensidades nos canais 535 e 450 nm para a determinação do sinal de medida proporcional. Tal como mostrado na Figura 2B, os núcleos e citosol de células são segmentados utilizando o canal de DRAQ5. Em seguida, o algoritmo é capaz de detectar os 450 nm e os ns 535 populações de células positivas para o cálculo das proporções entre as duas intensidades de cada célula individual, que érepresentada como um histograma na Figura 2C. Baixos índices são obtidos para a cepa mutante contra altos índices para a cepa virulenta. Embora esta experiência representativa infecção foi adquirida através de microscopia confocal, microscopia de epifluorescência, também é adequado para esta tarefa Figuras 3 e 4 mostram exemplos usando dois diferentes tipos de células humanas:. Células epiteliais HeLa e células THP-1, macrófagos, como. Após a infecção com a estirpe Shigella M90T AFAI virulenta, durante 1 hora e 90 min para células HeLa e células THP-1, um interruptor de sinal de verde (535 nm) para o azul (450 nm) é observada em comparação com as células infectadas BS176 AFAI (Figuras 3A e 4A). O script desenvolvemos em software Metamorph detecta directamente a população positiva CCF4 das células e calcular a relação entre as intensidades de 450 e 535 nm, para cada um dos canais de células individuais. Em seguida, as células são classificadas como uma função da sua relação com uma macro desenped no Excel, obtendo-se assim os histogramas que mostram a distribuição das células. Tal como tem sido o caso para o outro roteiro desenvolvido para Acapella, BS176 células infectadas AFAI são caracterizados por rácios baixos, enquanto que as células infectadas AFAI M90T exibem elevados índices usando o algoritmo MetaMorph sobre as células HeLa e as células THP-1, macrófagos (Figuras 3B e 4B) . Finalmente, uma adaptação deste método para o estudo das micobactérias é mostrado na Figura 5. Mycobacterium bovis BCG reside no fagossoma durante todo o decurso da experiência, tal como reflectido pela forte sinal detectado 535 nm ao longo do decurso de tempo da experiência. Em contraste, o Mycobacterium tuberculosis provoca a ruptura da membrana phagosomal THP-1 em macrófagos, após mais de 3 dias de infecção, conforme salientado por um sinal de 450 nm a 7 dias após a infecção (Figura 5A e 5B). Usando o mesmo algoritmo para estudar ruptura vacuolar por Shigella </em&gt;, descobrimos que as células infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis apresentar maiores proporções 450/535 nm do que Mycobacterium bovis BCG após 7 dias de infecção (Figuras 5C e 5D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que representa o princípio do ensaio para rastrear CCF4-AM/β-lactamase Shigella flexneri ruptura vacuolar. CCF4-AM difunde livremente através da membrana do plasma para o citoplasma, onde porções éster são clivados por esterases citossólicas produtoras CCF4 aniões. Esta reacção CCF4 impede a entrada de qualquer membrana compartimento incorporado. Neste passo, CCF4 provoca FRET a 535 nm após excitação a 405 nm. A sonda permanece intacta até bactérias expressando β-lactamase RUPTURE o vacúolo endocytic. Neste passo, o sinal FRET é perdido porque CCF4 é clivada por β-lactamase provocando uma mudança na emissão de 535 nm a 450 nm após excitação a 405 nm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> Figura 2. Acompanhando ruptura Shigella flexneri vacuolar utilizando microscopia confocal. (D) Após 2 h 30 min de carregamento CCF4-AM, células HeLa são infectadas com o β-lactamase expressa Shigella flexneri BS176 AFAI estirpe mutante ou o M90T AFAI estirpe virulenta, durante 1 hora e fixos , utilizando 4% de paraformaldeído durante 10 min. Em seguida, os núcleos são corados com DRAQ5 e as células são fotografada usando um microscópio confocal com uma objetiva de 10x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais incorporadas: a sonda intacta CCF4 aparece em 535 nm (green), a sonda clivada CCF4 aparece em 450 nm (azul). (B) Exemplos de fotos destacando o sistema de detecção do nosso algoritmo automatizado no software Acapella. A segmentação das células (núcleos + citosol) é obtido através do canal de DRAQ5. CCF4 células positivas são obtidos utilizando os canais 450 e 535 nm agrupados juntos. (C) Histograma mostrando o resultado de nossa análise automatizada em Acapella usando Shigella flexneri BS176 AFAI cepa mutante ou M90T AFAI cepa virulenta. O rácio significativo representa a relação entre a intensidade dos canais 450 e 535 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> Figura 3. Rastreamento Shigella fleruptura vacuolar xneri em células HeLa, utilizando microscopia de epifluorescência. (D) Após 2 h 30 min de CCF4-AM carregamento, as células HeLa são infectadas com o β-lactamase expressa Shigella flexneri BS176 AFAI estirpe mutante ou o M90T AFAI estirpe virulenta, durante 1 hora e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min. Em seguida, as células foram fotografadas usando um microscópio de epifluorescência, com uma objectiva 20x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais:. CCF4 intacto sonda de 535 nm (verde) e CCF4 clivados sonda 450 nm (azul) (B) Histograma que representa o resultado de nossa análise automatizada de software MetaMorph. As células individuais são distribuídas em função da sua relação das intensidades nos canais 450 e 535 nm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; Figura 4. Acompanhando Shigella flexneri ruptura vacuolar em células THP-1, utilizando microscopia de epifluorescência. (D) Após 2 h 30 min de carregamento CCF4-AM, THP-1 As células são infectadas com o β-lactamase expressa Shigella flexneri BS176 AFAI estirpe mutante ou o M90T AFAI estirpe virulenta, durante 1 h 30 min, e fixo por meio de 4% de paraformaldeído durante 10 min. Em seguida, as células foram fotografadas usando um microscópio de epifluorescência, com uma objectiva 20x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais:. CCF4 intacto sonda de 535 nm (verde) e CCF4 clivados sonda 450 nm (azul) (B) Histograma que representa o resultado de nossa análise automatizada usando o software MetaMorph. As células individuais são distribuídas em função da sua relação das intensidades nos canais 450 e 535 nm. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Acompanhando o Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis ruptura phagosomal THP-1 em macrófagos, utilizando microscopia de epifluorescência. (A, B), THP-1 As células são infectadas com β-lactamase expressa Mycobacterium bovis BCG ou Mycobacterium tuberculosis durante 2 horas e cultivadas durante 3 a 7 dias . Após a lavagem, as células são carregadas com CCF-4-AM durante 2 horas e fixo, utilizando 4% de paraformaldeído durante 30 min antes de imagem usando um microscópio de epifluorescência, com um objectivo de 40x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais: intacto CCF4 sonda, 535 nm (verde); clivada CCF4, sonda 450 nm (azul) (C, D) histogramas apresentando o resultado de nossa análise automatizada usando software MetaMorph.. As células individuais são distribuídas como função da razão entre a intensidade dos canais 450 e 535 nm.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias intracelulares<em&gt; Shigella flexneri<em&gt;</em</em&gt; E<em<em&gt;<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt;</em</em&gt; Após a invasão da célula hospedeira. Nosso ensaio faz uso de CCF4, uma série citoplasmática FRET sonda em células vivas ou fixo. Este repórter é degradada pela actividade de uma enzima presente na superfície bacteriana.

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

single-cell-measurements-vacuolar-rupture-caused-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K visualizações.  Institut Pasteur, Paris, France. Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias intracelulares Shigella flexneri

Vídeo: Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualização e Quantificação de Interações intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos e α-actinina por Imagem Confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Imunologia e Infecção

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...