A falta de marcadores específicos de nanotubos de tunelamento restringe o progresso no campo e há uma demanda crescente por um método para identificar, caracterizar e quantificar nanotubos de tunelamento. Os métodos de detecção automática são difíceis de implementar sem a experiência para desenvolver um algoritmo e / ou alterar o algoritmo existente, mas nosso método manual é fácil de implementar com melhor precisão. A transferência intercelular de longo alcance através de nanotubos de tunelamento é implementada de várias maneiras em vários modelos de doenças, incluindo patologia neurodegenerativa, disseminação viral e câncer.
Assim, estudos sobre nanotubos de tunelamento para entender seu papel na patogênese são importantes. É possível que os nanotubos de tunelamento se quebrem durante o processo de coloração. Evite usar folhas de cobertura e montagem nas lâminas, usando pratos de imagem de fundo de vidro.
O protocolo de fixação modificado ajuda a manter os nanotubos de tunelamento intactos. Demonstrando o procedimento estará Deepak KV, um estudante de doutorado do laboratório de Sangeeta NAF. Para começar, lave as células de controle e oligoméricas tratadas com A-beta duas vezes com PBS por dois minutos antes da fixação.
Preparar a solução fixadora de Karnovsky usando fixador de formalina a 2% e glutaraldeído a 2,5% dissolvido em tampão fosfato molar a 0,1 de pH 7,2. Em seguida, fixe as células no prato de imagem adicionando a solução fixadora de Karnovsky por 45 minutos à temperatura ambiente. Preparar o tampão de incubação dissolvendo 0,1 grama de saponina em cinco mililitros de FBS e diluído adicionando 95 mililitros de PBS.
Em seguida, lave as células fixas duas vezes usando tampão de incubação por dois minutos. Após a fixação, adicione o primeiro anticorpo contra a fosfo-PAK1, adicione uma diluição de um a 250 no tampão de incubação e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara escura e úmida. No dia seguinte, após 24 horas de incubação, lave as células duas vezes com o tampão de incubação por dois minutos.
Em seguida, adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 e à Faloidina 555. Incubar as células na câmara escura e húmida durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células duas vezes com tampão de incubação por dois minutos.
Coloração do núcleo adicionando DAPI em uma diluição de um a 2000 e incubar por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Prepare o meio de montagem DABCO usando 25 miligramas de DABCO em 90% de glicerol e 10% PBS. Para dissolver corretamente, ajuste o pH para 8,6 usando ácido clorídrico diluído de grau espectrofotométrico e mantenha a solução em um balancim para mistura.
Como agente antibranqueador, adicione o meio de montagem DABCO diretamente no prato de imagem que contém a tampa na parte inferior. Aguarde pelo menos uma a duas horas e prossiga diretamente para realizar imagens confocais. Para identificar nanotubos de tunelamento, capture imagens de pilha Z de células imunocoradas usando um microscópio confocal de varredura a laser, primeiro selecionando os canais e clicando nos lasers necessários sequencialmente nas janelas track one, track two e track three no software confocal.
Clique na opção TPMT abaixo da janela de faixa um para obter as imagens de contraste de interferência diferencial com canais de fluorescência. Selecione a guia Aquisição do software, clique na guia Z-stack e aguarde a abertura de uma janela. Em seguida, clique em Live Scan para focar as células na parte inferior do prato.
Selecione essa imagem focada como a primeira pilha e, em seguida, foque para cima para ver a parte superior da célula e selecione-a como a última pilha. Pare a varredura ao vivo e clique no número ao lado da guia Ótimo para corrigir o tamanho da etapa das pilhas, que determina o número de fatias e os intervalos com base na espessura das células. Tire imagens sequenciais de três canais de DAPI, FITC e TRITC com lasers de 405 nanômetros, 488 nanômetros e 561 nanômetros e capture com um tempo de permanência de pixels de 1,02 microssegundo.
Capture imagens no canal DIC com canais de fluorescência para observar o limite celular. Abra as imagens confocais salvas no formato de dados czi no software Fiji para análise. Selecione a opção Hyperstack para ver cada Z-stack e canal da imagem.
Role o canal e as barras de rolagem Z-stack para selecionar a pilha exata de um determinado canal de interesse. Em seguida, selecione o canal manchado de actina F primeiro rolando a barra de canais e role manualmente as pilhas Z para ver cada pilha uma a uma. Identifique as estruturas coradas com actina F que parecem estar conectando células que são visíveis nas partes inferiores das pilhas Z e estão próximas à superfície do prato de imagem com Z igual a dois como neurites.
Identifique os nanotubos de tunelamento, a célula de pairar positiva para os condutos de célula positiva F, rolando as pilhas Z em direção ao topo de Z igual a quatro. Procure neurites perto das partes inferiores das pilhas Z em direção à superfície e observe que elas começam a desaparecer com a rolagem das pilhas Z em direção ao topo em Z igual a seis. Identifique nanotubos de tunelamento positivos para fosfo-PAK1 de forma semelhante aos nanotubos de tunelamento positivos para F-actina, analisando a natureza flutuante dos conduítes das pilhas Z.
Como a coloração fosfo-PAK1 é mais fraca do que a coloração F-actina, procure nanotubos de tunelamento corados fosfo-PAK1 em Z igual a quatro e em Z igual a seis. Além disso, observe as imagens DIC para verificar se as estruturas de nanotubos de tunelamento coradas com F-actina e fosfo-PAK1 são condutos de membrana entre as células. Além disso, mescle os canais F-actina e fosfo-PAK1 para verificar se os nanotubos de tunelamento identificados são estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1.
Para quantificar os nanotubos de tunelamento, conte o número total de células e os nanotubos de tunelamento identificados manualmente e represente os números como porcentagens. Para distinguir nanotubos de tunelamento positivo de tubulina F e beta III, como conduítes pairando de imagens de pilha Z, mescle os canais de tubulina F-actina e beta III e, em seguida, analise as pilhas Z das imagens mescladas. Procure nanotubos de tunelamento exclusivamente corados com actina que sejam fracamente visíveis em Z igual a três e proeminentes em Z igual a seis e Z igual a nove.
Da mesma forma, identifique F-actina e beta III tubulina. nanotubos de tunelamento duplo-positivos como conduítes pairando em Z igual a seis e Z igual a nove. Identifique outras saliências não pairantes coradas de F-actina e beta III das partes inferiores das pilhas Z.
Meça o diâmetro dos nanotubos de tunelamento usando a ferramenta Line em Fiji. Verifique a escala de medição clicando em Analisar e, em seguida, defina a escala para que a distância em pixels seja definida automaticamente a partir das imagens czi. Meça os diâmetros dos nanotubos de tunelamento no plano XY.
Usando o plugin Volume Viewer em Fiji, que permite o refatiamento 3D e a visualização 3D habilitada para limite, divida as imagens Z-stack em canais individuais. Em seguida, corte as imagens de pilha Z de canal único para usar a visualização de reconstrução 3D para destacar um ou dois nanotubos ou neurites de tunelamento de cada vez. Fixe um único nanotubo de tunelamento ou neurito no plano XY e marque as seções transversais de acesso XZ e YZ.
Observe os neurites na parte inferior do plano XZ, nos planos XZ e YZ, e os nanotubos de tunelamento nas pilhas Z superiores. Selecione os nanotubos ou neuritos de tunelamento individuais para reconstruir a visualização do volume 3D no plano XZ. Na reconstrução 3D, observe os neurites na parte inferior do plano Z e os nanotubos de tunelamento aparecendo como estruturas pairando conectando duas células sem tocar no plano Z inferior.
Imagens confocais de Pilha Z de células imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 foram analisadas para identificar nanotubos de tunelamento. Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas dos nanotubos de tunelamento coradas com F-actina e fosfo-PAK1 eram condutos de membrana entre as células. As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e beta III tubulina e os condutos de membrana duplamente positivos de nanotubos de tunelamento e de encapsulamento de nanotubos F-actina e beta III tubulina foram distinguidos de apenas nanotubos de tunelamento positivos para F-actina.
Os nanotubos de tunelamento co-expressos com fosfo-PAK1 e F-actina foram distinguidos das saliências celulares de outros neuritos através da construção de imagens de visualização de volume 3D com base em sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato. O uso de agente fixador direito é importante, pois a fixação imperfeita da amostra pode levar à rápida degradação proteolítica das proteínas-alvo e a uma redução na imunorreatividade específica.
