Agradecemos Adam Coster e todos os outros membros dos laboratórios Altschuler e Wu para feedback útil e discussões. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde concede R01 GM085442 e CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), ea Fundação Welch I-1619 (SJA) e I-1644 (LFW).

1. Preparação de amostras e de imagem <ol><li> Cultura celular <ol><li> Dividir culturas rotineiramente e manter a 20-70% de confluência. Um dia antes da experiência, crescer as células HeLa em DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, ver Tabela de Materiais) e suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino) e 1x penicilina / estreptomicina. </li><li> No dia do experimento, dividir células crescendo em cultura (cerca de 50% confluentes). </li><li> Lavar as células com PBS (Tampão fosfato salino), expor a cerca de 2 ml de tripsina / EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) durante alguns segundos. Aspirar o excesso de tripsina / EDTA e manter as células banhadas por uma película fina de tripsina / EDTA na capa à TA durante ~ 3 min. </li><li> Mecanicamente agitar frascos duas vezes e separar as células com a mídia soro suplementado. Contagem de células e diluir para 5000 células/50 l de media e placa imediatamente 50 ul / poço em uma placa de fundo de 384 poços de vidro usando um líquido manipulação robô automatizado (apenas 30 bems da placa são usadas aqui). </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente durante 30 min para minimizar os efeitos de borda em poços 5. Após RT incubação, colocar as placas de 37 ° C / 5% de CO2 durante a noite. </li><li> Cada droga serão testados em duplicata. Adicionar 25 ul de fármaco para as cavidades correspondentes da placa contendo já mídia. </li><li> Fix placa com solução de paraformaldeído 4% em PBS a 24 horas após o tratamento de drogas. </li></ol></li><li> Coloração Os anticorpos específicos primários, anticorpos secundários marcados fluorescentemente e outros corantes fluorescentes que foram utilizados aqui são listados na Tabela de Materiais. <ol><li> Permeabilizar as células fixadas com 0,2% de Triton X-100 em solução de TBS (solução salina tamponada com Tris), durante 3 minutos, e lava-se com TBST (soro fisiológico tamponado com Tris, Tween 20 +) 3x. Adicionar a solução de 5% de BSA (Albumina de Soro Bovino) em TBST durante o bloqueio. </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas e, em seguida, lavar 3x com TBST. </li><li> Faça dilut anticorpo primárioiões em BSA a 5% em TBST (ver Tabela de Materiais) e adicionam-se 10 ul / poço. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas, e, em seguida, lavar 3x com TBST. </li><li> Faça dilutionin anticorpo secundário 5% BSA em TBST (ver Tabela de Materiais) e adicionar 10 mL / poço. </li><li> Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 2 horas e, em seguida, lavar duas vezes com TBST. </li><li> Preparar diluições para Hoechst e phalloidin (ver Tabela de Materiais) em PBS e adicionar 10 mL / poço. </li><li> Incubar a placa no escuro durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Após 2 lavagens TBST, placas de cobertura em folhas e armazenar a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imagem Adquirir imagens usando um microscópio de epifluorescência, utilizando objetiva de 20X com câmera 1x1 binning. Adquirir dezesseis imagens para cada bem, para um total de 480 imagens (canais x3). </li></ol> 2. Analisando Images Baixe e instale PhenoRipper de phenoripper.org e lançar PhenoRipper para começar a análise de images. PhenoRipper atualmente suporta TIFF, PNG, JPEG e e todos os outros formatos suportados pelo MATLAB (software microscópio normalmente suportam exportação para TIFF). 2.1 Carregando dados <ol><li> Não existe convenção de nomenclatura / organização padrão para imagens de microscopia, que podem fazer o carregamento de imagens e metadados associando (ou seja, anotação experimental, como tipo de tratamento, bem número e assim por diante) a parte mais desafiadora do fluxo de trabalho. Escolha um dos métodos apresentados (descrito abaixo). <ol><li> PhenoLoader: Escolha essa opção para semi-automaticamente carregar os dados quando o nome do arquivo e / ou estrutura de diretório contém informações suficientes para imagens de grupo se for o caso (por exemplo, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png pode indicar que a imagem é do bem B16, as células são tratadas com a droga cujo ID é 5, ea imagem captura a mancha DAPI nuclear - com esta convenção de nomenclatura, todas as imagens do poço A1 ou tratados com drogas 5 poderiam ser facilmente agrupados). O assistenteguiar o usuário passo a passo para associar metadados com grupos de imagens e definir os marcadores da seguinte forma: <ol><li> Clique em &quot;Estrutura do arquivo&quot; para acessar a janela PhenoLoader. </li><li> Clique em &quot;Definir diretório raiz&quot; para selecionar o diretório que contém o conjunto de dados de imagem. Em seguida, filtrar os arquivos que não são usados ​​(os arquivos não utilizados) para a análise (opcional, pode ser deixado vazio). </li><li> Clique em &quot;Definir marcadores&quot; para especificar os biomarcadores utilizados no experimento e associá-los com as imagens. Especificamente, clique em um arquivo de imagem, em seguida, selecionar uma parte do nome do arquivo que identifica os biomarcadores. Por fim, digite um nome para cada biomarcador. </li><li> Clique em &quot;Definir Metadados&quot; para associar informação com cada imagem. Especificamente, clique em um arquivo de imagem e, em seguida, selecionar uma parte do nome do arquivo as informações de identificação de imagem (por exemplo, &quot;B16&quot; para o nome também). Uma janela pedindo um nome de grupo (por exemplo, &quot;Nósll &quot;) irá aparecer, digite um nome. Os membros do grupo extraído do nome do arquivo será mostrado na tabela de grupo (por exemplo, a lista completa de nomes bem). Para adicionar informação adicional não presente no nome do arquivo, clique no botão&quot; (opcional) Next &quot;. Clique em&quot; Adicionar metadados Grupo &quot;, digite o nome do grupo adicional (por exemplo,&quot; Drogas &quot;) e para cada valor do grupo pré-definido (por exemplo,&quot; Bem &quot;), digite o seu valor (por exemplo,&quot; Taxol &quot;) . Não há nenhum limite para o número de grupos adicionais que podem ser adicionados. </li><li> Por fim, clique em &quot;Criar MetaDataFile&quot; para gerar o arquivo de metadados e continuar a análise. Se um arquivo de metadados foi gerado anteriormente, os passos acima podem ser evitadas por carregar diretamente o arquivo usando a opção &quot;Metadata File&quot; (descrito no 3 abaixo). </li></ol></li><li> Modelos de Expressões Regulares base: As expressões regulares são uma abordagem padrão para os padrões de correspondênciano texto. Escolha essa opção quando o nome do arquivo e / ou estrutura de diretório contém informações suficientes para imagens de grupo e a convenção de nomenclatura corresponde a um dos modelos pré-existentes. Modelos personalizados baseados on expressões regulares também definir e reutilizados manualmente. Esta opção avançada é recomendado apenas para usuários familiarizados com expressões regulares. </li><li> Metadados Arquivo: Escolha essa opção para customização final. Definir e carregar um arquivo de valores separados por vírgulas (CSV) contendo nomes de arquivos e metadados associados a cada imagem. Um exemplo do formato de arquivo está disponível na parte de download do site (phenoripper.org). Basta carregar o arquivo através da interface para exibir as informações que ele contém. </li></ol></li><li> Selecione o campo de metadados que define repetições no experimento para evitar amostragem redundante. Para conjuntos de dados que contêm repetições (por exemplo, todas as imagens em um poço deve ser semelhante), agrupando-os (por exemplo, também) pode imprdesempenho ove. Na maioria dos casos, é razoável escolher a opção padrão &quot;aleatório (não sei)&quot;, que seleciona um subconjunto aleatório. </li></ol> 2.2 Definir Parâmetros de análise Clique em &quot;Definir parâmetros&quot; para definir os parâmetros necessários para processar o conjunto de dados. Os parâmetros para definir estão no painel à esquerda. O painel direito exibe uma amostra do conjunto de dados resultante da fusão. Clique nas setas para a esquerda / direita para alternar entre diferentes imagens. <ol><li> Threshold Intensidade: Escolha um valor limite apropriado para identificar cerca de porções celulares (em vez de fundo, as regiões alveolares) de imagens. Um limiar é pré-calculada pela PhenoRipper, mas pode ser modificada para melhorar o realce de regiões celulares utilizando a barra de posicionamento disponíveis na parte superior da imagem. Se um limite escolhido não funciona em todas as imagens, baixar o limiar de modo a incluir as regiões alveolares, em vez de cair regiões celulares. </li><li> Bloco Size: Escolha um tamanho de bloco apropriado (em pixels) a grade da imagem. Blocos de tamanho especificado será sobreposta à imagem. Ajuste o tamanho do bloco para obter uma média de 20-30 blocos / celular. Para sobrepor a grade sobre a imagem clique na caixa de seleção em frente ao campo &quot;Tamanho do bloco&quot;. </li><li> Parâmetros opcionais: Se as imagens auto-escalados não exibem marcadores com intensidades relativas desejados (por exemplo, uma cor é saturada) ou se os marcadores precisam ser descartados da análise, use a opção &quot;ajustar a intensidade Channel&quot;. Para identificar as regiões celulares em um subconjunto dos marcadores de usar os canais utilizados &quot;Limiar para&quot; opção. Opções padrão de outros parâmetros geralmente são suficientes, mas se necessário, ajustá-los usando as &quot;Opções avançadas de análise&quot;. </li><li> Executar a análise com a tecla &quot;PhenoRip&quot; no painel principal do aplicativo. PhenoRipper irá identificar automaticamente tipos de blocos recorrentes nas imagens. Perfis fenotípicos serão gerados paracada imagem com base nas fracções de diferentes tipos de blocos na mesma. </li></ol> 3. Resultados Explorando <ol><li> Explorar as relações entre os perfis fenotípicos das imagens utilizando o PhenoBrowser (Figura 1). A interface PhenoBrowser consiste em quatro painéis: o painel superior esquerdo é uma representação gráfica (gráfico de dispersão) da semelhança relativa entre diferentes imagens / condições, os dois painéis sobre as imagens de amostra mostrador direito de condições seleccionadas e do painel final (gráfico de barras ) compara os perfis fenotípicos. </li><li> &quot;Descartar Frames vazios&quot; usando o menu &quot;Processamento de Dados&quot;. </li><li> Remover imagens de baixa qualidade: Primeiro, para estudar imagens individuais desativar o agrupamento a partir do menu &quot;Processamento de Dados&quot;. Em seguida, clique através dos pontos de outlier no gráfico de dispersão e descartar imagens de baixa qualidade (por exemplo, fora de foco, artefato de coloração). </li><li> Explorar os dados: Decida quais metadados campo defineuma unidade de base de comparação (por exemplo, para comparar as drogas, as imagens com o mesmo valor do campo de metadados &quot;droga&quot; precisa ser agrupados). Recolher todas as imagens com o mesmo valor deste campo de metadados em um único ponto de dados com o &quot;Group By&quot;. Por exemplo, o agrupamento por droga, em média, as imagens dentro de cada droga para produzir um ponto por droga. Pontos no gráfico de dispersão próximos (ou distantes) refletem as condições que provocam fenótipos celulares semelhantes (ou diferentes). Cor ou etiqueta pontos (menu de exibição de dados) com base em metadados disponíveis para ajudar interpretabilidade. O enredo 3D é rotativo, clicando na caixa de seleção &quot;rotativo&quot; e clicando no botão esquerdo e arraste o mouse sobre ele. </li><li> Selecione dois pontos diferentes para compará-los diretamente. Os painéis de imagem irá exibir imagens de amostra para cada ponto, eo painel de gráfico de barras vai mostrar os tipos de blocos cuja ocorrência freqüências são mais diferentes entre os dois pontos. </li><li> Lançamento do clustergram do menu &quot;clustergrama&quot; para fornecer uma visão mais global da relação entre os tipos de blocos e condições experimentais. Ao agrupar os dois tipos e condições de bloco, esta representação destaca os fenótipos celulares que melhor distinguem grupos de condições (Figura 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O fluxo de trabalho descrito aqui permite a caracterização e comparação de imagens de microscopia fácil e rápido. Primeiro, demonstrou como esse fluxo de trabalho pode ajudar a otimização experiência, por exemplo, realizando rapidamente o controle de qualidade em imagens de microscopia. Em seguida, demonstrou seu potencial para a análise de dados high-throughput screening: fomos capazes de drogas do grupo com base em seu mecanismo de ação. O agrupamento de drogas foi comparável à observada usando métodos ...

Ao longo da última década, os avanços rápidos na tecnologia de imagem têm dado muitos laboratórios a capacidade de realizar microscopia de alto rendimento. O desafio agora mudou de uma das imagens de uma das análises. Como podemos caracterizar, comparar e explorar a torrente de fenótipos ainda sutis complexas geradas por uma tela de imagem típico de alto rendimento? Um número de imagem de análise e de informática plataformas deram usuários caixas de ferramentas sofisticadas 1-3 para a extração de informação biológica de grandes coleções de imagens. No entanto, muitos obstáculos significativos permanecem na análise de dados de telas com base em imagens de alto rendimento. Dificuldades com a escolha de caracterizações adequadas das imagens e ajuste fino de parâmetros algorítmicos (para o sistema de juros) muitas vezes resultam em longos tempos de preparação, especialmente para usuários sem conhecimentos de análise de imagem. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais numaimagem n, é um gargalo importante a este respeito. A segmentação pode ser altamente sensível aos parâmetros experimentais, tais como tipo de célula, a densidade celular e bio-marcadores, e frequentemente requer ajuste repetido para um grande conjunto de dados. Por estas razões, a análise de imagem é muitas vezes um passo independente, o terminal realizadas pelos especialistas, em vez de uma parte integrada do fluxo de trabalho experimental. Isto impede o ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, uma parte crucial do desenvolvimento do ensaio. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho alternativo que é otimizado para a microscopia de fluorescência de alto rendimento e evita muitas das dificuldades acima mencionadas. Para isso, fazemos uso de PhenoRipper 4, uma plataforma de software de código aberto para a exploração e análise de imagens de microscopia rápida. Significativamente, PhenoRipper evita muitos dos desafios envolvidos com a segmentação celular por não tentar identificar células individuais. Em vez disso, PhenoRipper divide a imagem em pixelsblocos de tamanho sub-celular e caracteriza imagens em termos de blocos que contêm. Especificamente, PhenoRipper perfis blocos em termos de co-localização com base em marcadores de recursos e automaticamente identifica quatro tipos mais representativos do bloco nas imagens de treinamento. PhenoRipper depois atribui a cada bloco do tipo de bloco mais representativo semelhante, e, finalmente, caracteriza imagens com base nos tipos de blocos que contêm. Comparado a-baseados em células únicas abordagens mais tradicionais, esta abordagem exige sintonia fina mínima e especialização. Como tal, os usuários só precisa definir dois parâmetros: o tamanho do bloco e uma intensidade limiar (para descartar porções alveolares de uma imagem), os quais são definidos com feedback gráfica. É importante ressaltar que o fluxo de trabalho descrito aqui foi mostrado 4 de escalar facilmente para conjuntos de dados muito maiores, onde a velocidade e afinação mínima fornece grande tempo e ganhos de confiabilidade. Na prática, vemos que este aplicativoroach reduz o tempo necessário tanto para a instalação e funcionamento por várias ordens de magnitude 4. A saída primária de PhenoRipper é uma representação visual da imagem semelhança, que permite ao usuário para identificar grupos de condições experimentais que causam as células para exibir fenótipos semelhantes. Os agrupamentos PhenoRipper encontra normalmente têm &quot;interpretabilidade biológica&quot; comparável com aqueles gerados por mais, os métodos baseados em células demoradas 4. Na prática, isso significa que, muitas vezes, dentro de meia hora de realizar um típico 96 poços experimento microscopia de fluorescência, um experimentador sem experiência de imagem de análise prévia pode obter uma leitura confiável sobre o desempenho de seu experimento. O experimentador pode, então, começar a explorar as relações entre as diferentes condições experimentais e relacionando estas relações para fenótipos de imagem. Demonstramos esse fluxo de trabalho aqui, analisando os efeitosde drogas nas aulas mecanicistas distintos sobre as células HeLa coradas para marcadores de DNA e do citoesqueleto. Imagens de células tratadas com a mesma classe de drogas foram agrupados, e imagens de baixa qualidade (artefatos de coloração, fora das células de foco e assim por diante) apareceu como discrepantes, tornando-os fáceis de identificar e, potencialmente, descartar. Enquanto o fluxo de trabalho é útil para um grande número de ensaios com base em imagens, é evidente que existem muitas situações em que uma abordagem diferente poderia ser potencialmente mais informativa. Por exemplo, a saída de PhenoRipper é principalmente uma comparação relativa dos padrões de fluorescência em diferentes condições experimentais. Se uma caracterização absoluta de uma característica única célula específica foi necessária em vez (por exemplo, o número de manchas de uma célula), uma única célula com base na análise seria necessária. Todavia, mesmo neste tipo de situação, é provável que PhenoRipper detectar mudanças nesses fenótipos de uma única célula e, portanto, ser uma ferramenta útil para o ensaio optização.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Apesar de rápidos avanços na microscopia de alto rendimento, ensaios baseados em imagem quantitativos ainda representam desafios significativos. Embora uma variedade de ferramentas de análise de imagem especializados estão disponíveis, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em imagem-análise tradicionais têm curvas de aprendizado íngremes (para ajuste fino dos parâmetros da análise) e resultar em longos tempos de resposta entre imagem e análise. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais de uma imagem, é um importante ponto de estrangulamento, a este respeito. Apresentamos aqui, um fluxo de trabalho livre de segmentação de células-alternativo baseado em PhenoRipper, uma plataforma de software de código aberto projetado para a análise e exploração de imagens de microscopia rápida. O gasoduto apresentado aqui é otimizada para imagens de microscopia de imunofluorescência de culturas celulares e exige intervenção mínima do usuário. Dentro de meia hora, PhenoRipper pode analisar os dados a partir de um típico de 96 poços experimental e gerar perfis de imagem. Os usuários podemem seguida, explorar visualmente os seus dados, realizar o controle de qualidade em sua experiência, garantir uma resposta às perturbações e verificar a reprodutibilidade de repetições. Isso facilita um ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, o que é crucial durante a otimização do ensaio. Este protocolo é útil não apenas como uma análise de primeira passagem para o controlo de qualidade, mas também pode ser usado como uma solução de ponta-a-ponta, especialmente para o rastreio. O fluxo de trabalho descrito aqui dimensionado para grandes conjuntos de dados, tais como os gerados por telas de alto rendimento, e tem sido demonstrado que grupos de condições experimentais pelo fenótipo com precisão ao longo de uma vasta gama de sistemas biológicos. A interface PhenoBrowser fornece uma estrutura intuitiva para explorar o espaço fenotípica e relacionar as propriedades de imagem para anotações biológicas. Tomados em conjunto, o protocolo descrito aqui vai diminuir as barreiras para a adoção de análise quantitativa de telas de imagem baseado.

Aqui nós testamos a capacidade de fluxo de trabalho para este grupo de drogas com base no seu mecanismo de ação. As células HeLa foram semeadas em 30 cavidades de uma placa de 384 cavidades e coradas para ADN / actina / α-tubulina. Os anticorpos específicos primários, anticorpos secundários marcados fluorescentemente, e outras manchas fluorescentes que foram utilizados são listados na Tabela de Materiais. Os poços foram tratadas com 15 medicamentos pertencentes a três classes mecanicistas (inibindo histonades...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para rapidamente analisar e explorar coleções de imagens de microscopia de fluorescência usando PhenoRipper, uma plataforma de análise de imagem recentemente desenvolvido.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K visualizações.  UT Southwestern Medical Center.  Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para rapidamente analisar e explorar coleções de imagens de microscopia de fluorescência usando PhenoRipper, uma plataforma de análise de imagem recentemente desenvolvido. 

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These processes are characterized by the gradual appearance of essential structures in the megakaryocyte cytoplasm such as a polyploid and polylobulated nucleus, an internal membrane network called demarcation membrane system (DMS) and the dense and alpha granules that will be found in circulating platelets. In this article, we describe a standardized protocol for the in situ ultrastructural study of murine megakaryocytes using transmission electron microscopy (TEM), allowing for the identification of key characteristics defining their maturation stage and cellular density in the bone marrow. Bone marrows are flushed, fixed, dehydrated in ethanol, embedded in plastic resin, and mounted for generating cross-sections. Semi-thin and thin sections are prepared for histological and TEM observations, respectively. This method can be used for any bone marrow cell, in any EM facility and has the advantage of using small sample sizes allowing for the combination of several imaging approaches on the same mouse.

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Here, we present a protocol to analyze ultrastructure of the megakaryocytes in situ using transmission electron microscopy (TEM). Murine bone marrows are collected, fixed, embedded in epoxy resin and cut in ultrathin sections. After contrast staining, the bone marrow is observed under a TEM microscope at 120 kV.

In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...