Este método foi projetado para quantificar a concorrência dependente de contato através do sistema de secreção tipo VI entre cepas bacterianas no nível único celular. Esta técnica usa a área total celular em vez da contagem de células para quantificar competições bacterianas, facilitando para pesquisadores sem acesso a softwares proprietários de análise de imagens. Este método pode ser facilmente modificado para quantificar a concorrência entre diversos micróbios culturais.
Além disso, a configuração experimental pode ser otimizada para uso em microscópios eretos ou invertidos. Para começar, prepare a solução de almofada de agarose dissolvendo agarose de derretimento 2% de baixa em PBS marinho. Aqueça a solução brevemente por cerca de 30 segundos no micro-ondas e vórtice até que a agarose esteja completamente dissolvida.
Mantenha esta solução em um banho de água de 55 graus Celsius até estar pronto para usar. Em seguida, enrole um pedaço de fita de laboratório em torno de um slide de vidro cinco vezes. Repita o embrulho da fita no mesmo slide, de talto que a distância entre as duas peças de fita seja ligeiramente menor do que a largura do deslizamento de tampas.
Para garantir uma superfície plana da almofada de agarose, a pipeta aquece a solução entre as duas peças de fita e imediatamente colocar um deslizamento de tampa em cima de talão de talão faz contato com o líquido e empurra para fora quaisquer bolhas na solução agarose. Deixe a almofada de agarose solidificar à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Em seguida, corte esta almofada de agarose com uma lâmina de barbear em quatro almofadas de 5 milímetros quadrados para ser usado para imagens.
Para preparar as cepas para a co-incubação, retire cada cepa de estoques congelados para as placas de ágar LBS complementadas com os antibióticos apropriados e incubar durante a noite a 24 graus Celsius. No dia seguinte, escolha duas colônias de cada cepa e resuspense as colônias em meio LBS suplementado com antibióticos. Incubar colônias resuspended durante a noite a 24 graus Celsius com agitação a 200 rotações por minuto.
Na manhã seguinte, a subcultura de cada biológico replica um em 1.000 vezes médio LBS fresco sem antibióticos e incuba até que as células atinjam uma densidade óptica de cerca de 1,5 a 600 nanômetros. Meça e regisse a densidade óptica em 600 nanômetros para todas as amostras. Normalize cada amostra para uma densidade óptica de uma, diluindo a cultura com meio LBS.
Misture as duas cepas concorrentes em uma proporção igual adicionando 30 microliters de cada cepa normalizada a um tubo de 1,5 mililitro rotulado. Vórtice a cultura da tensão mista por um a dois segundos. Misture as cepas concorrentes para cada réplica biológica e tratamento para gerar um total de quatro tubos de tensão mista.
Concentre cada cultura mista três vezes por centrifugação para garantir células concorrentes suficientemente densas para matar dependente de contato durante a co-incubação. Descarte o supernatante, resuspenque cada pelota em 20 microlitres de média LBS e realize procedimentos de concentração para cada amostra. Se a imagem em um microscópio invertido, comece detectando dois microlitros de uma cultura mista no número 1.5 tampa fundo de uma placa de Petri de 35 milímetros e coloque a almofada de agarose sobre o ponto de co-incubação.
Coloque uma tampa de vidro circular de 12 milímetros sobre a almofada de agarose. Repita a mancha e a colocação de coberturas para as três culturas mistas restantes, o que resultará em quatro pratos a serem imageados. Antes de seguir em frente, deixe os slides sentarem no topo do banco por cerca de cinco minutos para permitir que as células se instalem na almofada de ágar para evitar o movimento durante o processo de imagem.
Comece focando nas células que usam DIC para minimizar os efeitos de fotobleaching. Com base no tamanho médio de uma única célula bacteriana, use um objetivo de óleo de 100X. Ajuste o tempo de exposição e as configurações de aquisição para cada canal com detecção mínima de fundo.
Selecione pelo menos cinco campos de exibição e adquira imagens em cada canal apropriado. Abra o software de análise de imagens e importe os arquivos de imagem a serem analisados. Converta a imagem em escala de cinza, separe os canais e comece por limiar e criando uma máscara binária da imagem pré-processada.
Selecione Analisar e, em seguida, no menu suspenso, selecione Definir escala e digite os valores apropriados para a configuração de microscopia. Em seguida, vá para definir medidas e selecione Área. Em guia de análise, selecione analisar partículas usando as configurações padrão.
Se os detritos estão presentes na amostra, o tamanho ou circularidade pode ser ajustado para filtrar partículas não celulares. Selecione Mostrar e, em seguida, Contornos para que a saída da análise do filtro inclua um esboço numerado de todas as partículas analisadas. Exporte as medidas em software de planilha para análise e grafia posterior.
As imagens representativas da fluorescência de cada tratamento experimental são mostradas. Concentrar a cultura mista antes das manchas resultou em células-alvo arredondadas ou desaparecidas ao longo de duas horas, indicando inibição bem sucedida. Quando a cultura mista não está concentrada, as células permanecem dispersas no escorregador.
Sem contato celular-celular suficiente, a cepa alvo não é inibida pela cepa letal. As células-alvo não desapareceram nem ficaram arredondadas quando co-incubadas com um mutante T6SS em condições lotadas ou dispersas. Assim, o alvo foi desinibido em ambos os tratamentos.
Os resultados da análise de partículas foram gráficos e analisados tanto para a cepa alvo quanto para a cepa inibidora. Maiores de 100% da área alvo inicial no momento final representam um aumento líquido na meta e inferior a 100% da área alvo inicial indicou uma diminuição líquida na meta. O crescimento líquido da cepa inibidora foi observado em todos os tratamentos.
No entanto, a porcentagem da área inicial para a cepa inibidora foi significativamente maior quando um inibidor do tipo selvagem foi co-incubado com o alvo em condições de aglomeração em comparação com todos os outros tratamentos. Para obter imagens claras, a almofada de agarose precisa ser o mais plana possível. Corte as peças de fita antes de envolvê-las ao redor do slide para garantir que elas tenham o mesmo comprimento.
