dd-PCR é um método altamente sensível e preciso para quantificação absoluta de DNA ou RNA alvo. Ele tem sido usado para o diagnóstico de doenças onde outros métodos convencionais não conseguem dar resultados precisos. dd-PCR é a técnica mais sensível para detectar moléculas de ácido nucleico abundantes muito baixas.
Ao contrário da PCR quantitativa, a dd-PCR não requer nenhum controle genético de limpeza para quantificação. Devido à sua sensibilidade e precisão, a dd-PCR pode ser usada como uma ferramenta para diagnóstico molecular e pesquisa envolvendo moléculas de RNA de baixa abundância, como micro RNAs e RNAs circulares. Antes de usar dd-PCR, deve-se realizar RT-PCR ou RT-qPCR para confirmar que os primers estão amplificando seus genes-alvo sem qualquer amplificação de PCR inespecífica.
Para começar, prepare uma sequência de modelo de PCR de 200 nucleotídeos de comprimento, unindo os últimos 100 nucleotídeos do comprimento total da sequência circular de RNA aos primeiros 100 nucleotídeos da sequência circular de RNA. Use a sequência de modelos para primer, projetada pela ferramenta da Web Primer 3. Pegue um prato de 10 centímetros contendo cerca de 5 milhões de células mioblásticas C2C12 proliferantes e um miotubo C2C12 diferenciado de quatro dias para isolamento de RNA.
Lave as células com 10 mililitros de 1X PBS três vezes e descarte o PBS usando uma pipeta. Adicione um mililitro de reagente de isolamento de RNA e lise as células por pipetagem vigorosa. Em seguida, adicione 200 microlitros de clorofórmio e vórtice por 15 segundos.
Centrifugar o tubo a quatro graus Celsius por 10 minutos a 12.000 G.Pegue 400 microlitros da camada aquosa superior, carregue-o em uma coluna de sílica e centrifugar por um minuto a 12.000 G à temperatura ambiente. Leve o fluxo para um novo tubo e adicione 600 microlitros de etanol a 100%. Adicione 20 microlitros de contas de sílica magnética e coloque o tubo em um termificador, ajustado a 25 graus Celsius e 1.200 RPM por cinco minutos.
Em seguida, coloque o tubo num suporte magnético durante 30 segundos ou até que a solução fique límpida. Ressuspeite as esferas de sílica magnética em 500 microlitros de tampão de lavagem contendo etanol a 90%. Depois de colocar o tubo no suporte magnético por 30 segundos, deixe as contas se acomodarem em direção ao ímã e descarte o buffer usando uma pipeta.
Seque o tubo ao ar livre a 50 graus Celsius por três minutos em uma terminadora, mantendo a tampa aberta. Adicione 20 microlitros de água livre de nuclease e ressuspenda as contas. Coletar o RNA dissolvido em um novo tubo para avaliação de quantidade e qualidade usando um espectrofotômetro.
Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro e pegue um micrograma de RNA para a síntese de cDNA. Misture um micrograma de RNA total com um microlitro de mistura de dNTP, quatro microlitros de tampão transcriptase reversa 5X, dois microlitros de primer aleatório de transcriptase reversa 10X, 0,25 microlitros de enzima transcriptase reversa e 0,5 microlitros de inibidor de RNase. Completar o volume para 20 microlitros usando água livre de nuclease.
Coloque o tubo a 25 graus Celsius por 10 minutos, seguido por 50 graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque o tubo a 85 graus Celsius por cinco minutos para inativar a enzima. Configure a reação de PCR de 22 microlitros em tubos ou tiras de PCR de 0,2 mililitro, juntamente com um tubo de controle negativo e tubos de controle sem modelo.
Adicione 11 microlitros de mistura mestre dd-PCR, 5,5 microlitros de mistura de primer circular específica de RNA para frente e para trás de uma concentração micromolar e 5,5 microlitros de água livre de nuclease para configurar os tubos de reação NTC. Da mesma forma, para configurar os tubos de reação de ensaio, adicione 11 microlitros de mistura mestre dd-PCR, 5,5 microlitros de RNA circular específico para frente e mistura de primer reverso de uma concentração micromolar e 5,5 microlitros de cDNA. Para a geração de gotículas, transfira 20 microlitros da mistura de PCR de tubos de PCR de 0,2 mililitros para os poços de amostra do cartucho gerador de gotículas.
Adicione 70 microlitros de óleo de geração de gotículas aos poços de petróleo do cartucho do gerador de gotículas com cuidado, usando uma pipeta. Cubra o cartucho do gerador de gotículas com uma junta de borracha e coloque-o na máquina geradora de gotas para obter a mistura de gotículas de óleo de amostra, gerada nos poços de gotículas do cartucho. Para amplificação por PCR, transfira 40 microlitros da mistura de gotículas de óleo da amostra dos poços de gotículas do cartucho gerador de gotículas para uma placa de PCR de 96 poços usando uma pipeta.
Sele a placa de PCR de 96 poços com o selador de folha de alumínio. Coloque-o no bloco da máquina seladora de placas, pré-aquecido a 180 graus Celsius, e clique no selo para selar a placa de PCR. Em seguida, coloque a placa no termociclador dd-PCR e defina a temperatura da tampa para 105 graus Celsius e uma taxa de rampa para dois graus Celsius por segundo.
Quando a PCR terminar, coloque a placa na máquina conta-gotas dd-PCR com o suporte da placa na posição correta para contar as gotículas. Abra o software de análise de gotículas e configure a execução fornecendo informações de amostra. Clique no botão analisar para analisar os dados após a conclusão da leitura da gota.
Em seguida, clique no botão Amplitude 1D para ver as gotículas positivas e negativas. Para segregar as gotículas positivas das gotículas negativas, coloque uma linha de limiar comum para todas as amostras com o mesmo alvo. Clique no botão exportar para exportar os dados de contagem de RNA circular como um arquivo csv.
Os dados exportados mostram o número de RNAs circulares presentes em cada amostra. Calcule manualmente o número de RNAs circulares em cada amostra por nanograma de RNA, considerando a quantidade total de cDNA usada em cada reação. A análise de dados usando o software QuantaSoft é mostrada aqui.
Todas as amostras, exceto MT1, apresentaram mais de 12.000 contagens de gotículas. Como a contagem total de gotículas foi baixa em MT1, esta amostra não foi considerada para a análise final dos dados. Curiosamente, houve uma clara diferença no padrão de expressão de Circ B e C2 na condição diferenciada de quatro dias do miotubo em comparação com as células mioblásticas.
A análise da abundância de Circ B e C2 em termos de número de cópias, indicou que as três repetições de mioblastos C2C12 tinham 76,8, 67 e 46 cópias por nanograma de RNA, enquanto as duas amostras de miotubo tinham 558 e 610 cópias por nanograma de RNA. Os dados no gráfico de barras representam a média mais menos o desvio padrão de duas a três replicações biológicas. ddPCR é um dos métodos mais avançados para medir a expressão diferencial precisa do RNA circular alvo.
Este método será uma ferramenta essencial para acelerar a pesquisa circular de RNA e as indústrias de diagnóstico no próximo ano.
