Esta técnica utiliza imagens de PET para elucidar a distribuição e dinâmica in vivo das células B no sistema nervoso central. Nossa abordagem é benéfica para o estudo de doenças neurológicas, onde a medula afetada torna a análise mais desafiadora. Portanto, existem algumas vantagens principais para a nossa técnica.
Primeiro, criamos uma nova ferramenta para rastrear um biomarcador de células B pan que nos permite capturar uma gama de subconjuntos de células B e visualizá-los in vivo. Em segundo lugar, nosso método de análise medular permite a quantificação altamente precisa e reprodutível dos sinais de PET nesta região. A grande coisa sobre a nossa técnica é que ela é agnóstica de doenças.
Pode ser usado desde a imagem pré-clínica até a clínica por PET em qualquer cenário em que as células B e/ou a medula espinhal sejam de interesse. 18 a 24 horas após a marcação radiológica e a injeção do anticorpo no camundongo, prepare o camundongo para a varredura aplicando gel ocular nos olhos. Certifique-se de que a cama de varredura de quatro mouses esteja equipada com uma almofada de aquecimento com isoflurano ajustado de 1,5 a 2% Coloque o mouse em posição supina na cama de digitalização e puxe suavemente a cauda do mouse para endireitar a coluna.
Quando o rato estiver em posição supina, tape-o com fita adesiva macia sobre a cabeça e a barriga para minimizar o movimento da respiração. Faça um registro da posição de digitalização de cada mouse em um bloco de anotações de laboratório. Depois de fixar o primeiro grupo, feche a cama e verifique a colocação do leito executando uma tomografia computadorizada.
Clique em CT Center Field of View e, uma vez que a cama esteja em posição, execute o exame de tomografia computadorizada para garantir que a colocação está correta. Repita até que a posição do leito esteja satisfatória. Coloque uma pequena fita branca sobre a cama do scanner para marcar o posicionamento correto da cama para o restante do estudo.
Abra o menu Controlador de movimento e clique em Campo de visão do centro de PET para mover os mouses para o anel PET. Uma vez que o leito esteja no anel PET, inicie a sequência de varredura clicando em Executar, e aguarde até que o scanner conclua automaticamente o PET scan, e passe do anel PET para a TC para aquisição da TC. Desde a encefalomielite autoimune experimental, ou EAE, os ratos têm curvatura pronunciada da coluna vertebral devido à progressão da doença, escaneá-los enquanto estão de costas ajuda a endireitar a coluna.
Faça uma incisão pelo lado dorsal do animal e remova a pele e o pelo para expor a coluna vertebral. Corte ao longo de três planos transversais através da coluna vertebral no pescoço, diretamente sob a caixa torácica e no topo da pelve para separar a região lombar das regiões cervical e torácica. Remova cuidadosamente a coluna vertebral segmentada para obter duas peças, torácica lombar e cervical.
Em seguida, isole a coluna lombar cortando cuidadosamente a coluna vertebral da extremidade pélvica até que a medula lombar seja visível. Para expulsar a medula espinhal lombar, use uma seringa deslizante preenchida com PBS e crie um selo entre a seringa e a coluna vertebral usando o polegar e o indicador. Empurre suavemente o PBS através da seringa para expulsar a medula espinhal para uma almofada absorvente e repita para a medula espinhal torácica cervical inserindo a seringa do lado cervical.
Coloque os tecidos da medula espinhal em um tubo de contagem gama. Registre o peso seco e adicione PBS para garantir que o tecido esteja no fundo do tubo para evitar a secagem. Coloque o tubo no gelo até ficar pronto para a contagem.
Para iniciar a análise das regiões de interesse na medula espinhal, abra a Ferramenta de Região de Interesse 3D no menu Navegação. No cabeçalho Regiões de interesse, use o sinal de mais na parte inferior do menu para criar seis regiões de interesse, região lombar de interesse, região torácica cervical de interesse, esqueleto lombar, esqueleto torácico, medula espinhal lombar, medula espinhal torácica. Para evitar interferência visual do sinal PET, clique em F3 para desligar o PET.
Vá para a parte superior do Operador da Ferramenta de Região de Interesse 3D e clique no ponto sólido à direita do símbolo do cursor para abrir o Modo de Pintura 3D e o menu Erode/Dilatar. Selecione Esfera e altere o tamanho para 20 pixels. Da mesma forma, defina dilatar para mais cinco.
Antes de prosseguir, vá para a parte inferior do menu e verifique se a região lombar de interesse está selecionada. Na TC, encontrar a vértebra L6 da coluna vertebral. Começando com uma vértebra acima de L6, desenhe uma região lombar áspera de interesse sobre as cinco vértebras acima dos quadris.
Em seguida, mude para a região cervical torácica de interesse e trace o restante da coluna até a base do crânio. Depois de desenhar as regiões de interesse generalizadas, vá para a parte superior do operador e selecione o menu Algoritmos de segmentação. No menu suspenso, selecione Otsu Thresholding, selecione a região lombar de interesse para a entrada e verifique se o esqueleto lombar é escolhido na parte inferior do menu.
No menu suspenso ao lado de Imagem, verifique se a tomografia computadorizada está selecionada, indicada aqui pelo número zero. Clique em Aplicar e repita o procedimento para a região cervical torácica de interesse e esqueleto torácico. Depois de usar o Otsu Thresholding para criar as regiões de esqueleto de interesse, retorne ao menu Navegação e exclua a região de interesse ou marque a coluna H para as regiões torácicas lombares e cervicais ásperas de interesse para ocultá-las.
Marque a coluna I para ambas as regiões esqueléticas de interesse, para que elas não possam ser editadas. Finalmente, retorne ao topo da Ferramenta de Região de Interesse 3D e vá para o menu Pintura 3D para desenhar as regiões da medula espinhal de interesse. Selecione a ferramenta Esfera novamente e trace a medula espinhal dentro do esqueleto para o lombar e o torácico, garantindo que a região correta de interesse seja selecionada na parte inferior do menu.
Para apagar qualquer região de interesse, clique em Comando/Controle e desenhe sobre a peça a ser apagada. Verifique a região da medula espinhal de interesse a partir dos três planos para garantir que nenhuma região de interesse seja desenhada fora da coluna vertebral. Se o sinal PET foi desligado, pressione F3 depois que as regiões da medula espinhal de interesse forem desenhadas para ligar o PET novamente, ou selecione o Visual Controller e clique na barra PET.
Volte para o menu Navegação. Clique no ícone Grade para mostrar a tabela. Copie a tabela para o software de planilha e salve o arquivo.
A imagem PET revelou ligação elevada do radiotraçador no cérebro e na medula espinhal torácica de camundongos EAE em comparação com os camundongos virgens. A contagem gama ex vivo mostrou ligação aumentada nos segmentos espinhal torácico lombar e cervical, e no cérebro de camundongos EAE em comparação com virgens. Imagens de autorradiografia ex vivo mostraram aumento da ligação do radiotraçador em cortes cerebrais sagitais, especificamente no tronco encefálico, cerebelo e ventrículos de camundongos EAE em comparação com camundongos virgens.
Da mesma forma, um aumento da ligação do radiotraçador foi observado nos segmentos da medula cervical torácica e lombar de camundongos EAE em comparação com a medula espinhal virgen. Após a PET e a contagem gama, podemos investigar a relação entre o sinal do PET e o alvo de interesse através de técnicas de biologia molecular, como citometria de fluxo e imunohistoquímica. Nossa técnica abriu caminho para que os pesquisadores fizessem perguntas sobre o papel in vivo das células B em várias áreas de doenças, incluindo acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, outras doenças autoimunes e câncer.
