As culturas organotípicas do córtex adulto humano são até agora o único sistema para testar terapias com células-tronco para o córtex danificado que permite estudar a interação entre células hospedeiras humanas enxertadas e humanas. Uma terapia testada em modelos animais geralmente falha quando traduzida para os ambientes clínicos devido às diferenças entre células de roedores e humanos. Aqui, podemos estudar células enxertadas, sobrevivência, diferenciação e funcionalidade em um ambiente de humano para humano.
Essa metodologia nos ajudará a entender como o circuito neural opera no cérebro humano e também estimulará a tradução desse conhecimento nos ambientes clínicos para melhorar a recuperação funcional após danos cerebrais. Demonstrando o procedimento estarão Raquel Martinez-Curiel, aluna de doutorado, e Costanza Aretio-Medina, mestranda, ambas do meu laboratório. Para começar, coloque as inserções de cultura em uma placa de seis poços usando fórceps no laboratório de cultura celular sob um exaustor ventilado.
Adicione cinco mililitros do meio cortical adulto humano na parte inferior da inserção até que ele entre em contato com a membrana. Evite a formação de bolhas e adicione dois mililitros do meio em cima da pastilha. Antes de transferir as fatias de tecido para as inserções, equilibre-as na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos duas horas.
Colete o tecido do paciente na sala de cirurgia em um recipiente de solução de corte congelada, borbulhada e esmagada. Transfira o recipiente fechado no gelo imediatamente para a área de corte do laboratório. Inspecione o tecido e, considerando a orientação da camada cortical, localize a melhor superfície para colá-la ao estágio de corte do vibratome.
Se necessário, corte a superfície irregular com o bisturi para colocar o tecido no palco para uma orientação ideal da fatia. Em seguida, cole o tecido no palco com adesivo de tecido. Coloque-o na câmara de corte e encha-o imediatamente com uma solução de corte fria e borbulhada.
Continue o borbulhar durante todo o processo de corte. Agora corte fatias coronais ou sagitais, dependendo da orientação do tecido para a lâmina, conforme descrito no manuscrito. Coloque as fatias na câmara de recolha com solução de corte borbulhante à temperatura ambiente.
Uma vez que todo o tecido tenha sido cortado, transfira as fatias para uma placa de Petri estéril com solução de enxágue à temperatura ambiente para remover o excesso de sacarose das fatias e transportá-las para o laboratório de cultura celular. Em seguida, coloque as fatias de tecido individualmente em cima das inserções molhadas e submersas. Após 24 horas, troque o meio para remover qualquer sacarose remanescente ou outras substâncias residuais do procedimento de corte.
Após duas semanas, use meio cortical adulto humano sem gentamicina. Retirar o meio do balão de cultura celular. No sétimo dia de diferenciação, desprenda as células GFP-lt-NES corticalmente preparadas adicionando 500 microlitros de tripsina e incube por 5 a 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione um volume igual do inibidor de tripsina seguido por cinco mililitros de meio DDM. Ressuspenda as células, transfira suavemente a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugar por cinco minutos a 300 G.Enquanto isso, transfira a placa contendo o tecido humano da incubadora para o exaustor e remova dois mililitros de mídia do topo da inserção. No final da centrifugação, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em uma matriz de membrana basal fria e pura e transfira a pensão para um tubo menor.
Recolher a suspensão celular num capilar de vidro frio ligado a uma tetina de borracha para sucção. Injete a suspensão celular como pequenas gotas, esfaqueando o corte de tecido semi-seco em vários locais. Deixe o gel solidificar a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, transfira a placa da incubadora de volta para o exaustor e adicione cuidadosamente dois mililitros de meio cortical adulto humano ao topo da inserção para submergir completamente o tecido. O tecido cortical adulto humano agudo mostrou a presença de neurônios, oligodendrócitos e astrócitos exibindo preservação ideal do tecido. O tecido apresentou a expressão dos marcadores neuronais NeuN e Map2 após duas semanas de cultura celular.
O registro do grampo do remendo de célula inteira mostrou que os neurônios tinham potencial de membrana de repouso sustentado e resistência à entrada de membrana, comparável aos neurônios de preparações agudas. As células eram ligeiramente menos ativas do que no tecido fresco, embora a maioria das células fosse capaz de disparar pelo menos um, se não múltiplos potenciais de ação. O tecido cortical agudo apresentou a expressão dos marcadores microgliais Iba1 e Tmem119.
Após duas semanas em cultura, a micróglia tornou-se menos ramificada e adquiriu uma morfologia mais ativada do que no tecido agudo. Quatro semanas após o transplante ex vivo, as células GFP-lt-NES enxertadas exibiram neurites estendidos com arborizações extensas e complexas em toda a cultura organotípica. Quase nenhuma célula enxertada sobreviveu em tecido mal preservado.
Detritos e marcação inespecífica de anticorpos em células mortas foram amplamente observados em toda a fatia humana. No caso de transplante bem-sucedido, as células tornaram-se funcionalmente ativas e os neurônios maduros apresentaram potenciais de ação repetitivos e muitas vezes espontâneos. Sódio rápido para dentro, correntes lentas de potássio para fora e um certo nível de atividade sináptica indicam integração funcional do enxerto com o tecido hospedeiro quatro semanas após o enxerto.
Quanto mais rápido o tecido humano é processado uma vez que está fora da sala de operação, maior a viabilidade do sistema e o sucesso do procedimento experimental.
