A avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. Os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos provaram ser um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Estabelecemos metodologias para investigar de forma abrangente a característica funcional dos cardiomiócitos derivados de iPSC humanos, que são de modelagem de doenças realmente importantes, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão.
A crescente incorporação de cardiomiócitos derivados de iPSC humanos no processo padrão de avaliações de segurança pré-clínicas tem o potencial de melhorar a precisão da previsão de toxicidade dos compostos de um candidato. Comece por cultivar os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos por pelo menos 10 dias antes de fazer a medição. Ligue o controlador de temperatura e defina-o a 37 graus Celsius.
Ligue o microscópio, a câmera e o suprimento de dióxido de carbono. Encha a camisa de água do suporte da placa com uma quantidade apropriada de água deionizada estéril. Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa e incube as células por pelo menos cinco minutos.
Abra o software de visualização e, em seguida, defina a taxa de fotogramas da câmara para 75 fotogramas por segundo e a resolução do vídeo ou da imagem para 1024 x 1024 píxeis. Aplique as funções de foco automático e brilho automático, grave vídeos e imagens de cardiomiócitos derivados de iPSC humanos. Coloque cuidadosamente uma gota de oito microlitros de solução de revestimento de matriz celular extra sobre a área do eletrodo de gravação de cada poço das placas de matriz de microeletrodos de 48 poços.
Em seguida, adicione três mililitros de água desionizada estéril à área ao redor dos poços para evitar a evaporação da solução de revestimento. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, remova a maior parte do meio da matriz celular extra da superfície do poço dentro da mesma fileira ou coluna sem tocar nos eletrodos. Semee 50.000 células por poço em uma gota de oito microlitros de meio de semeadura sobre a área do eletrodo de gravação.
Repita até que todos os poços tenham sido banhados com células. Em seguida, incube as placas de matriz de microeletrodos em uma incubadora de cultura de células umidificadas. Adicione lentamente 150 microlitros de meio de semeadura a cada poço das placas de matriz de microeletrodos.
No dia 10 pós-plaqueamento, verifique a densidade de batimento espontâneo humano iPSC CM monocamada sob um microscópio. Coloque a placa de matriz de microeletrodos de 48 poços no instrumento de gravação. Certifique-se de que a temperatura é de 37 graus Celsius e dióxido de carbono é de 5%Abra o software do navegador.
Na janela de configuração experimental, selecione a configuração cardíaca em tempo real e os registros de potencial de campo. Aplique configurações de batida espontâneas ou coladas. Nos parâmetros de detecção de batimento, defina o limite de detecção para 300 micro volts, o período mínimo de batimento para 250 milissegundos e o período máximo de batimento para cinco segundos.
Selecione regressão polinomial para o cálculo da duração potencial do campo. Verifique se o sinal de atividade elétrica basal está maduro e estável e adquira as atividades cardíacas basais por um a três minutos. Realizar a gravação 10 dias pós-plaqueamento.
Substitua o meio de manutenção iPSC CM humano pela solução de tyrode e permita que as células se aclimatem por 15 minutos. Insira os sensores de temperatura na câmara e coloque o prato de 35 milímetros dentro. Ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.
Puxe as micropipetas dos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipeta. Encha as micropipetas com a solução intracelular e insira-as no suporte ligado à fase principal do amplificador de braçadeira de patch. Abra o software de aquisição, carregue o protocolo de gravação do potencial de ação e selecione a configuração da braçadeira de tensão.
Insira a micropipeta na solução de banho e selecione CMs iPSC humanos únicos apropriados. Ajuste e abaixe a posição da micropipeta ao lado da célula selecionada usando um micromanipulador. Quando a ponta da pipeta for inserida na solução de banho, verifique a resistência da pipeta no monitor do osciloscópio.
Posicione a pipeta perto da célula e os pulsos de corrente diminuirão ligeiramente para refletir a crescente resistência à vedação. Aplique uma sucção suave com pressão negativa para aumentar a resistência. Isso formará um gigaseal.
Em seguida, aplique a função de vedação. Aplique sucção adicional para quebrar a membrana para obter uma configuração de gravação de célula inteira. Neste ponto, mude do modo de pinça de tensão para o modo de braçadeira de corrente ou nenhuma injeção de corrente usando o diálogo do amplificador.
Pressione o botão de gravação para gerar e salvar os arquivos de gravação em potencial de ação. Realizar a medição do transiente de cálcio pelo menos 10 dias após o plaqueamento. Prepare a solução de tiro fresco e a solução de carregamento Fura-2 AM.
Aspirar o meio de manutenção iPSC CM humano e lavar as câmaras com a solução de tiro duas vezes. Aplicar 100 microlitros de solução de carregamento Fura-2 AM e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Substitua a solução de carregamento de Fura-2 AM pela solução de tyrode e incube por pelo menos cinco minutos para desesterificação completa de Fura-2 AM. Adicione uma gota de óleo de imersão na objetiva de imersão em óleo 40x de um microscópio de epifluorescência invertida.
Coloque a câmara celular no adaptador de estágio do microscópio. Instale os fios do controlador de temperatura na câmara de banho e configure-o para 37 graus Celsius. Instale os eletrodos de estimulação de campo elétrico e defina os pulsos em 0,5 hertz com uma duração de 20 milissegundos.
Ligue a fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra alta velocidade e defina-a para o modo de comutação rápida de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Aplique um tempo de exposição de 20 milissegundos para ambos os comprimentos de onda e um tempo de gravação de 20 segundos. Grave o vídeo refletindo as mudanças em tempo real do transiente de cálcio, exporte os dados para uma planilha para análise.
A monocamada de cardiomiócitos derivados de iPSC humano foi utilizada para a mensuração do movimento de contração. A análise de um traço do movimento de relaxamento da contração usando o software analisador detectou o início das contrações, o pico de contração, o fim da contração, o pico de relaxamento e o fim do relaxamento. A cobertura total da monocamada de cardiomiócitos derivados de iPSC humano foi observada em todos os eletrodos dentro das placas de matriz de microeletrodos.
As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo refletiram o potencial do campo cardíaco com características identificáveis. Após a análise, obtiveram-se o período de batimento, a duração do potencial de campo e a amplitude do pico. Registros de pinça de remendo de células inteiras no modo de pinçamento atual registraram os potenciais de ação espontânea de cardiomiócitos únicos.
Após a análise, vários parâmetros, incluindo a amplitude, o potencial diastólico máximo e a duração do potencial de ação foram obtidos. Após a análise da imagem de cálcio, obteve-se a relação F340 por F380 ao longo do tempo e plotaram-se vestígios brutos de transientes de cálcio estimulados. Além disso, parâmetros como amplitude, cálcio diastólico e tau de decaimento de cálcio foram obtidos.
É importante usar os cardiomiócitos derivados da iPSC humana que estão em boas condições de batimento, bem como garantir a alta pureza dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana. Este protocolo inclui quatro técnicas específicas para estudar a funcionalidade dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana, outra configuração ou o estudo automático das correntes iônicas cardíacas que desempenham um papel crucial no coração
