Este é o primeiro relato demonstrando que a injeção intramiocárdica percutânea de cardiomiócitos guiada por ecocardiografia aumenta significativamente a propriedade reparadora dos cardiomiócitos humanos derivados de iPS. Este método é factível, satisfatório, repetível, menos invasivo e eficaz para administrar terapia humana com cardiomiócitos derivados de iPS. Acreditamos que a administração intramiocárdica percutânea é um método seguro e eficaz para a administração local de drogas para doenças que incluem cardiopatia isquêmica, infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca.
Este projeto é supervisionado pelo Professor Jinfu Yang e pelo Professor Jun Peng. Demonstrando o procedimento estarão Xun Wu, Kele Qin e Kun Xiang, MD PhDs do meu laboratório e Di Wang, PhD do Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research. Para começar, aspirar a vácuo o sobrenadante da cultura a partir de uma cultura de 60 dias de hiPSC-CMs.
Lave as células com PBS três vezes. Em seguida, dissociar os hiPSC-CMs em células individuais usando a mistura de enzimas de desprendimento celular a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Recolher as células num tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI mais meio B27 e misturar.
Conte as células e calcule o número total de células. Centrifugar a suspensão celular a 300G por dois minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio suporte de cardiomiócitos até uma concentração de 6 x 10 das 4ª células por microlitro.
Coloque o tubo a 37 graus Celsius até a etapa de injeção. Depois que o camundongo estiver suficientemente anestesiado, fixe os membros e a cauda com fita adesiva. Em seguida, fixe os incisivos do mouse com um fio de seda 2/0 e fita.
Esterilizar a região mediana do pescoço e tórax esquerdo com três rodadas alternadas de betaína seguidas de álcool. Faça uma incisão cervical mediana usando tesoura anatômica fina e pinça dissecante fina. Corte alguns músculos cervicais anteriores para estabilizar e expor totalmente a traqueia.
Insira uma agulha de punção com cateter de calibre 20 como um tubo traqueal pela boca. Conecte o tubo traqueal ao ventilador e verifique se há movimento torácico para garantir que ambos os pulmões estejam bem ventilados. Ajuste os parâmetros respiratórios.
Em seguida, refixe o membro posterior esquerdo para o lado inferior direito e solte a fita ao redor do membro superior esquerdo. Com tesoura e pinça dissecante fina, realizar toracotomia nos três a quatro espaços intercostais do tórax esquerdo. Com o uso de pinças, descascar o pericárdio e localizar a artéria coronária descendente anterior.
Use um fio de seda 6/0 para ligar a extremidade proximal da artéria. Para garantir que o modelo de infarto agudo do miocárdio seja estabelecido, aguarde até que o lado distal da artéria no local da ligadura mude de vermelho para branco. Fechar o tórax camada por camada e suturar a pele com fio 4/0.
Para o grupo de animais simulados, realizar todos os procedimentos cirúrgicos, exceto a ligadura. Nas duas primeiras semanas após o infarto do miocárdio, coloque os camundongos em uma caixa de anestesia conectada com isofluorano a 5% e realize a intubação traqueal. Três dias antes da administração de hiPSC-CMs, injetar ciclosporina A na cavidade intraperitoneal na dose de 10 miligramas por quilograma por dia.
Retire os pelos do peito e abdômen superior do rato com creme depilatório. Fornecimento de isofluorano inalatório até que a frequência cardíaca seja mantida em 400 a 500 batimentos por minuto. Fixe os membros e a cauda do mouse com fita adesiva no console de detecção e defina a temperatura da plataforma em 37 graus Celsius.
Aplique a geleia de ultrassom na parte superior do abdômen. Usando uma sonda de ultrassom veterinário de alta resolução, obtenha imagens do fígado de camundongos. Com uma microseringa de cinco microlitros, sorteie aproximadamente 3 x 10 até o 5º hiPSC-CMs.
Segure a seringa e insira uma agulha de três milímetros no processo paraxifóide esquerdo. Sob orientação ultrassonográfica, siga a borda superior do diafragma. Observe o ritmo e a amplitude respiratória.
Entre no pericárdio no final do círculo expiratório, evitando danos ao fígado e ao pulmão. Em seguida, adquira a imagem paraesternal do eixo longo do coração de camundongos por ecocardiografia modo B. Sob orientação ultra-sônica, injetar 1 x 10 nas células do 5º hiPSC-CMs em cada uma das três áreas marginais do local do infarto.
Retire a sonda de ultrassom e enxágue a geleia. Desmame o rato da anestesia e devolva-o à sua gaiola. Injetar ciclosporina A continuamente por um mês após o transplante.
O ecocardiograma do ventrículo esquerdo mostrou que as lesões por infarto do miocárdio foram revertidas no grupo de dose múltipla. O transplante de MC-hiPSC também resultou em aumento da fração de ejeção e encurtamento da fração. A mensuração dos parâmetros cardíacos pelas colorações Sirius Red e Fast Green mostrou que o tamanho do infarto e a fração de volume de colágeno diminuíram, enquanto a espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo aumentou após o transplante.
A marcação para alfa actina inespecífica em verde, DAPI em azul e troponina T específica para humanos em vermelho mostrou a presença de células transplantadas na área de infarto e infarto marginal. O número e a porcentagem de células transplantadas foram maiores no grupo de dose múltipla em comparação com a dose única. 28 dias após o infarto do miocárdio, o grupo de dose múltipla apresentou aumento no número de células expressando o marcador de células endoteliais, I-B4.
A coloração de aglutinina do germe de trigo e alfa actinina sarcomérica nos cardiomiócitos mostrou redução no diâmetro mínimo da fibra. Menor número de núcleos de cardiomiócitos túnel positivos no grupo de dose múltipla indicou redução da apoptose. A análise por PCR detectou o DNA mitocondrial humano apenas no coração, mostrando transplante específico.
Ao inserir a agulha, certifique-se de que ela entre na cavidade pericárdica junto com a margem superior do diafragma e no final do círculo expiratório para evitar a lesão no fígado ou no pulmão.
