É difícil avaliar a função de sarcomere nos cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco devido ao seu sarcomere subdesenvolvido e desorganizado. Usando proteínas de sarcomere com marca fluorescente, agora podemos acessar o encurtamento de sarcomere. Podemos visualizar sarcomeres e avaliar sua função in vitro usando cardiomiócitos derivados de células-tronco e proteínas de sarcomere com marca fluorescente.
Usando a transdução baseada em AAV, podemos expandir o método para qualquer célula-tronco pluripotente induzida pelo paciente. Este método pode ser expandido para o desenvolvimento da terapia de cardiomiopatia, pois pode ser usado para avaliar diretamente a disfunção sarcomere relacionada à doença in vitro. Esse método é útil na área de cardiologia, incluindo o estudo de cardiologia pediátrica.
No entanto, também pode ser aplicado ao estudo da disfunção muscular esquelética, como a miopatia. No dia menos quatro de indução de diferenciação, cubra uma placa de seis poços com 0,5 microgramas por centímetro quadrado de laminina-511 E8 diluída em PBS para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aproximando-se do fim da incubação, trate as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem com trippsina recombinante por três minutos a 37 graus Celsius.
Quando as células se separarem, colhiu células para médio suplementadas com 10% de FBS para contagem, e resuspenque as células a uma 1,25 vezes 10 às quintas células por dois mililitros de AK02N médio suplementado com laminina-511 E8 e inibidor de ROCHA após centrifugação. Em seguida, aspire a solução de revestimento de cada poço da placa de seis poços, e semente dois mililitros de células em cada poço. Devolva a placa à incubadora de cultura celular.
Após quatro dias, as células atingem 80% de confluência. Substitua o supernasce em cada poço por dois mililitros de RPMI mais B27 sem insulina média suplementada com inibidor GSK-3 por poço para induzir a diferenciação. Após dois dias de diferenciação, substitua suavemente o meio por dois mililitros de RPMI mais B27 sem insulina média suplementada com inibidor de porco-espinho por poço.
As células deveriam ter atingido 100% de confluência. No quarto dia de diferenciação, substitua suavemente os supernantes por dois mililitros de RPMI mais B27 sem insulina por poço. As células devem permanecer em alta densidade, e algumas podem ter começado a flutuar.
Nos dias sete e nove de diferenciação, substitua o supernaente em cada poço por dois mililitros de RPMI mais B27 por insulina suplementada com puramicina para cultura de cardiomiócito pluripotente seletivo derivado de células-tronco. Neste ponto, as células batidas devem ser observadas dentro das culturas. Para configurar uma cultura de cardiomiócito pluripotente padronizada, primeiro use fita de remendamento para remover qualquer poeira da superfície de um selo PDMS personalizado, e submergir brevemente o selo em 70% de etanol.
Use um espanador de ar para remover o etanol da superfície do selo e trate a superfície com cinco a 10 microliters de polímero mpc e etanol de 0,5%. Quando o polímero estiver completamente seco, coloque o carimbo em uma tampa de polímero em uma folha de imagem de 35 milímetros e coloque um peso sobre o carimbo. Após 10 minutos, use um microscópio leve para confirmar que o padrão foi transferido para o deslizamento de cobertura, e lave o prato e cubra duas vezes com PBS.
Após a segunda lavagem, cubra a tampa com 0,5 a um micrograma por centímetro quadrado de laminina-511 E8 diluída em gelatina de 0,1% para uma incubação de duas a quatro horas à temperatura ambiente. No dia 10 de diferenciação, lave as células duas vezes com PBS, seguida de tratamento com um mililitro de trippsina recombinante por poço por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a contagem, resuspenque as células em um 2,5 a cinco vezes 10 para as quintas células por mililitro de RPMI mais B27 com insulina suplementada com concentração de puromicina, e sementes um mililitro de células na placa para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, substitua o supernaente por RPMI fresco mais B27 por insulina suplementada com puramicina, e devolva as células à incubadora de cultura celular, refrescando o meio de duas a três vezes por semana até os dias 21 a 28 para imagem. Para a imagem de lapso de tempo do encurtamento do sarcomere nas culturas DO PCCSM, aplique óleo à lente 100 vezes objetiva de um microscópio confocal fluorescente e selecione condições de imagem ao vivo no software associado. Para obter bons dados representativos, selecione a taxa de quadros mais alta, defina o obturador para abrir e aplique um binning de quatro por quatro em uma cultura da área de aquisição para obter os intervalos mais curtos entre as imagens durante a imagem de lapso de tempo.
Se a taxa de batida das células for baixa, evoque as células por estimulação de campo elétrico e inicie a gravação de lapso de tempo, tomando cuidado para que o campo de imagem permaneça em foco durante a imagem. No final do período de imagem, salve as imagens de lapso de tempo em uma pasta apropriada. Para analisar as imagens de lapso de tempo, abra uma série de imagens de lapso de tempo no ImageJ e ajuste o brilho e o contraste das imagens até que o padrão sarcomere possa ser claramente observado.
No menu Mais Ferramentas, selecione SarcOptiM e pressione o Controle Shift P e o botão um mícndo na barra de ferramentas para usar as instruções para calibrar o programa. Em seguida, desenhe uma linha através da região do sarcomere para ser usada para medir o encurtamento de sarcomere, e clique em Single Cell AVI para iniciar a análise de encurtamento de sarcomere. Imagens de lapso de tempo de cardiomiócitos pluripotentes com células-tronco padronizadas e padronizadas podem ser usadas para medir o encurtamento de sarcomere em diferentes pontos de tempo.
Para superar a desorganização sarcomere tipicamente observada em culturas de cardiomiócitos pluripotentes padronizadas derivadas de células-tronco, selos específicos de PDMS podem ser usados para cultivar cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco padronizados em um padrão de listras, o que promove uma forma celular alongada e um padrão de sarcomere mais organizado em comparação com células cultivadas em uma área não padrão. Culturas padronizadas também promovem uma melhor contração celular e fornecem um perfil suave de comprimento de sarcomere em comparação com células cultivadas sem padrão. Cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco derivados de células-tronco aAV expressam sinais sarcomericos de GFP ao longo dos cardiomiócitos pluripotentes padronizados derivados de células-tronco já em três dias após a transdução e também podem ser usados para medir perfis de contração de sarcomere.
Além disso, a adição de genes resistentes a blasticidinas durante a transdução também pode ser usada para facilitar a seleção de cardiomioces derivados de células-tronco pluripotentes padronizados a uma pureza de mais de 90% Para facilitar uma análise de imagem mais fácil e de maior qualidade, é essencial identificar uma área com sarcomeres que se movem linearmente e obter imagens na maior taxa de quadros. Usando este método, podemos avaliar o papel da maturação em proteínas de sarcoma para estudar a disfunção do sarcomere em cardiomiócitos de laboratório derivados de células iPS específicas da doença, derivadas do paciente.
