Este método permite registrar potenciais de ação intracelulares semelhantes em MEA'S tradicionais, permitindo assim uma melhor descrição da forma da PA e uma classificação mais sensível dos potenciais pró-arrítmicos. Em comparação com os registros típicos do potencial de campo, a forma potencial real intracelular fornece mais informações sobre a autorização precisa dos canais iônicos subjacentes. Quando aplicado a cardiomiócitos derivados de pacientes clínicos através da tecnologia de células-tronco, o método pode contribuir para o diagnóstico causal, e personalização de C R P e, doenças cardíacas como arritmias Nossa técnica, Karin Gebhardt irá demonstrar o cultivo de cardiomiócitos.
Para começar a revestir os campos de eletrodos dos MEAs previamente autoclavados, Dropwise com fibronectina usando uma pipeta de 10 microlitros sob o exaustor de fluxo laminar. Para reduzir o choque osmótico, transfira a solução de revestimento gota a gota por 90 segundos para o tubo de 50 mililitros contendo cardiomiócitos descongelados. Adicione suavemente oito mililitros de meio de chapeamento no tubo e misture a suspensão celular com cuidado.
Usando uma pipeta de 10 mililitros, remova o sobrenadante, garantindo não descartar o pellet e ajuste o número de células para a concentração final. Antes do assento da célula, remova a solução de revestimento aplicada da área do eletrodo MEA usando uma pipeta de 10 microlitros. Para evitar a secagem da semente de revestimento as células imediatamente, adicionando quatro microlitros das células gota a gota sobre os campos de eletrodos para ambos, seis poços MEA e um poço M E A.Agora, permita que as células adiram aos poços por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Sob o exaustor de fluxo laminar, adicione 200 microlitros e um mililitro de chapeamento estéril médio aquecido a 37 graus Celsius para seis Well MEA e MEA de poço único, respectivamente. Para gravações MEA, coloque o sistema MEA em cima do dispositivo com o suporte do chip MEA centralizado sobre o orifício da objetiva. Em seguida, permita que o laser se concentre nos eletrodos posicionando a configuração do MEA, de modo que a objetiva esteja diretamente sob o orifício do sistema MEA.
Para permitir que as células se recuperem da perturbação mecânica, transfira o chip MEA com as células cultivadas da incubadora para a configuração MEA 15 minutos antes da gravação. Em seguida, limpe as almofadas de contato e os pinos com cuidado, usando um cotonete de isopropanol para diminuir os níveis de ruído. Coloque o MEA cuidadosamente na configuração do MEA e posicione o chip MEA de seis poços com o número de série visível no lado direito ou um único chip MEA de poço com o eletrodo de referência à esquerda.
Agora, defina o sistema de aquecimento integrado MEA para 38 graus Celsius. Feche a tampa do dispositivo, pois o interruptor de segurança integrado só permite que o laser seja ativado se a tampa estiver fechada sobre o chip MEA. Usando o programa de configuração MEA, defina o filtro do sistema MEA passa-alta e passa-baixa para 0,1 hertz ou menos e 3.500 hertz, respectivamente.
Use o software de rack MC ou qualquer software alternativo para gravação. Ajuste o intervalo de entrada de acordo com o experimento. Garantir que o sinal não satura o amplificador e a taxa de amostragem.
Use a função de exibição de longo prazo do software para verificar a gravação. Depois de inserir o chip MEA na configuração do MEA e configurar o software, inicialize a mecânica do laser usando o software FB ALP. Agora, clique no botão de inicialização.
No final da inicialização, o ponto laser virtual estará no poço D para um MEA de seis poços e no canto inferior esquerdo para um único MEA de poço, respectivamente. Em seguida, usando a tecla de controle com um clique do mouse, mova o ponto laser virtual para o meio do eletrodo D cinco e ajuste o foco segurando a tecla de controle e rolando com a roda do mouse. Como alternativa, use a função de foco automático.
Pressione o botão definido P um e o ponto laser virtual se moverá automaticamente para o poço F.O sistema agora está alinhado. Ajuste a potência do laser e o tempo de processo de acordo com os requisitos experimentais. Para ativar o laser, clique no botão de desligamento do laser que aparecerá como laser ligado, Alterne para o software de gravação.
Escolha um nome de arquivo e clique no botão vermelho de gravação seguido pelo botão de reprodução na parte superior da janela para gravar a medição. Antes de abrir as células com o laser, grave uma linha de base por 60 segundos. Volte para o software de inicialização e desative os eletrodos a serem excluídos pelo laser no mapa virtual no lado direito da janela do software.
Para iniciar o laser use Alt clique do mouse, e selecione o eletrodo central deste poço. Isso inicia o laser para abrir as células em cada eletrodo deste poço automaticamente, repita para cada poço para abrir todos os eletrodos previamente ativados deste poço selecionado. Dissolva a concentração milimolar de Nifedipina E-40 31 e Dofetilida em DMSO primeiro e, em seguida, em meio completo até 10 vezes a concentração desejada.
Nunca exceda uma concentração final de DMSO de 0,1% no poço. Registre a atividade de linha de base por 60 segundos. Inicie a peração induzida pelo laser como demonstrado anteriormente, resultando em uma transformação do FPS em liAPs.
Aplique todas as drogas como concentração única por poço. Remova 20 microlitros e 100 microlitros de meio por poço de seis poços e MEAs de poço único, respectivamente. Adicione 20 microlitros ou 100 microlitros da solução de estoque de drogas a ser medida no poço.
Dependendo do tipo MEA, e cuidadosamente pipetar para cima e para baixo duas a três vezes. Deixe os compostos lavarem por 300 segundos. Durante esse tempo, a forma liAP pode se transformar na forma FP.
Novamente, o laser induzido induziu a peração e registrou possíveis defeitos induzidos por compostos no liAP por mais 60 segundos. A adição de nifedipina reduziu a fase de platô dos liAPs de maneira dependente da concentração e, assim, encurtou todo o liAP. Esse encurtamento foi comparável aos potenciais de campo dos cardiomiócitos de eletrodos não manipulados.
O E-40 31 inibiu a repolarização dos canais de potássio relevantes do KV um ponto 11 e levou ao comportamento arrítmico dos cardiomiócitos em concentrações aumentadas. Além disso, o E-40 31 aumentou a duração do liAP de maneira dependente da concentração. No final do liAP foram observadas pequenas deflexões de tensão positiva a 0,1 micromolar, que se tornaram mais proeminentes com concentrações mais elevadas, indicando uma nova despolarização transitória chamada EAD's.
Na concentração mais alta de 0,1 micromolar, esses EADs escalaram ao longo do tempo em batimentos ectópicos. Que são potenciais de ação prematura. EAD e batidas ectópicas são indicadores-chave da atividade pró-arrítmica.
E no final, a atividade elétrica resulta em batidas arrítmicas. As relações de resposta à concentração correlacionaram-se com os registros de FP's e liAP. Além disso, na presença de dofetilida, tanto FP quanto liAP apresentaram durações de aproximadamente dois segundos dentro do mesmo poço, a forma de onda FP apresentou deflexões regulares de repolarização.
Enquanto no liAP EAD's são detectáveis. É importante ajustar o foco antes que cada melomen, pois uma imagem de microscópio fora de foco pode afetar a abertura das células. Além disso, o potencial de ação é tomado logo após a opterperação deve ser usado para análise.
Esta técnica é mais sensível na detecção de efeitos arrítmicos prévios em comparação com o MEA padrão, permitindo mais precisamente a detecção de efeitos adversos de compostos.
