O objetivo geral deste procedimento é atingir seletivamente teratomas derivados de células-tronco em camundongos para avaliação da eficácia in vivo da radioterapia de feixe externo de pequenos animais. A principal vantagem da terapia de feixe de radiação externa é que é uma terapia direcionada para teramtomas associadas a células-tronco que evita os efeitos adversos fora dos alvos de terapias sistematicamente entregues. Os avanços na radioterapia de feixe externo permitiram o direcionamento específico de pequenos teratomas, evitando danos aos tecidos normais, tornando esta terapia ideal para o tratamento de teratomas sensíveis à radiação.
Esse método pode não apenas fornecer insights sobre a otimização de estratégias para terapias celulares, como também tem o potencial de se tornar clinicamente aplicável em terapias humanas. Comece tomando uma placa de seis poços contendo iPSCs. Induzir a formação de tetratoma em animais imunodeficientes adicione um mililitro de mistura de enzimas de dissociação celular recombinante por poço da placa de 6 poços contendo células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem transduzidas com um gene repórter de fusão dupla para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.
No final da incubação disperse as células por pipetação e pare a reação enzimática adicionando um volume igual de cultura celular média a cada poço. Puxe as suspensões de célula única em um tubo cônico de 15 mililitros para contar. Depois que a centrifugação estiver completa, aspire o supernascer e resuspense a pelota em 30 microliters da solução matricial Matrigel e coloque o tubo no gelo.
Se utilizando células transfecidas de fusão dupla, essas células de duplo efeito positivo também devem ser suspensas em 30 microliters de matriz. Em seguida, carregue cada população celular em uma seringa de um mililitro equipada com agulha de calibre 28,5 e confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em cada um rato receptor de nu atímico de 8 a 10 semanas de idade. Em seguida, subcutâneamente injete uma mistura de matriz celular no flanco dorsal de cada animal receptor.
No ponto de tempo experimental apropriado após a inoculação injetar 375 miligramas por quilograma de dilúvio intraperitoneal em cada receptor. Após 10 minutos de imagem, o sinal de bioluminescência em cada sonda anestinada injetou animal por 30 minutos usando janelas de aquisição de um minuto em intervalos de cinco minutos, de acordo com protocolos padrão de imagem de bioluminescência. Para irradiação de teratoma, no ponto de tempo experimental apropriado, primeiro coloque um animal receptor anestesiado na cama de um irradiador pré-clínico guiado por imagem e adquira um conjunto de 400 imagens de tomografia microcomputante de projeção acima de 360 graus usando uma quilovoltagem de 40 picos, feixe de raio-x de 2 milímetros e reconstrua a imagem em imagens volumétricas com um tamanho de pixel istropotrópico de 0,2 milímetros.
É fundamental reconstruir imagens volumosas dos teratomas. Essas imagens ajudarão a planejar os tratamentos de radiação para a entrega específica da terapia apenas aos teratomas, minimizando qualquer radiação fora do alvo dos tecidos circundantes. Em seguida, use as imagens micro-CT e o pacote de software de imagem RT para planejar um protocolo de tratamento de radiação.
Administre o tratamento por três dias consecutivos para entregar um total de 18 cinzas ao tumor alvo. Os camundongos injetados normalmente demonstram a formação de crescimento do teratoma de quatro a eigth semanas após a injeção de células tumorais, como confirmado por imagem de bioluminescência. Quando irradiados com um cumulativo faz 18 cinzas um mês após o parto das células, os tumores encolherão drasticamente resultando em uma diminuição significativa do sinal de luciferase.
É importante ressaltar que, como essas imagens ilustram, biópsias normais de tecido colhidas cinco mililitros do local irradiado não parecem sofrer nenhum dano significativo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara de como criar teratomas derivados de células-tronco in vivo e tratá-los de forma eficaz e segura com radiação de feixe externo. Esta abordagem simples requer a aquisição de imagens de tomografia de alta resolução de um sujeito após o qual uma série de terapias de feixe de radiação poderiam ser prescritas para irradiar os tumores alvo, evitando o tecido adjacente.
Não se esqueça que trabalhar com radiação pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso dos escudos apropriados, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
