Este protocolo é significativo porque fornece aos pesquisadores as habilidades para empregar corações humanos doadores para testes de drogas fisiológicas pré-clínicos. Este tecido utiliza corantes de tensão e cálcio para a caracterização simultânea de potenciais de ação cardíaca e transitórios de cálcio intracelulares em fatias de tecido humano. Para configurar o sistema de mapeamento óptico, conecte um banho de tecido com uma camada de gel de polidimtilsiloxano inferior a um sistema de perfusão e circule um litro de solução de recuperação a 37 graus Celsius oxigenado com 100% de oxigênio através do sistema de perfusão a uma taxa de fluxo rápido o suficiente para manter a temperatura e evitar o acúmulo de perfusato de banho.
Em seguida, use um alvo para ajustar o foco e o alinhamento das duas câmeras CMOS e use uma fonte de luz LED verde com um comprimento de onda de 520 mais ou menos cinco nanômetros para excitar os corantes sensíveis à tensão e indicadores de cálcio simultaneamente. Antes de obter seções teciduais, misture a solução de cardioplegia congelada e líquida e coloque o tecido cardíaco no banho de cardioplegia gelada e identifique a parede livre ventricular esquerda. Cole o gel de agarose pré-feito na parte de trás dos suportes de tecido metálico do vibratome.
Corte blocos de tecido em cubos de um centímetro em solução cardioplégica fria e use adesivo de pele tópico para montar rapidamente os blocos de tecido nos suportes de tecido metálico com as superfícies do endocárdio voltadas para cima. Transfira os suportes metálicos para o banho de vibratome da solução de corte oxigenado gelado para que os tecidos fiquem completamente submersos e mova a lâmina para a borda frontal do tecido. Ligue o vibratome para começar a cortar com os parâmetros predefinidos, descartando as primeiras várias fatias até que a lâmina atinja além da trabecula no tecido endocárdico liso.
Quando o tecido experimental for atingido, transfira cuidadosamente cada fatia em filtros individuais de células de malha de nylon de 100 micrômetros em um prato de cultura contendo a solução de recuperação de Tyrode oxigenada à temperatura ambiente e cubra as fatias com arruelas de malha para evitar que as fatias de tecido se enrolem. Quando todas as fatias tiverem sido coletadas, transfira cuidadosamente cada fatia em poços individuais de uma placa de seis poços contendo três mililitros de PBS por poço. Enxágüe a fatia com balanço suave e repita este processo três vezes com PBS fresco estéril antes de transferir as amostras para poços individuais de uma placa de seis poços contendo três mililitros de 37 graus Celsius de cultura média por poço.
Em seguida, coloque a placa em um agitador orbital a 20 revoluções por minuto em uma incubadora umidificada a 37 graus, 30% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Após 20 minutos de incubação em solução de recuperação para fatias recém-cortadas ou imediatamente após a colheita, transfira cuidadosamente a fatia de juros para o banho de tecido do sistema de perfusão e fixe os quatro cantos para a camada de gel enquanto aplica um estiramento mínimo ao tecido. Deixe as fatias descansarem neste banho com solução de recuperação circulante por aproximadamente 10 minutos antes de adicionar 0,3 a 0,5 microliters de estoque Blebbistatin ao reservatório de solução de recuperação.
Enquanto a fatia está incubando no Blebbistatin, reconstitua 30 microliters do corante sensível à tensão do estoque em um mililitro de solução de recuperação a 37 graus. Após 10 minutos de tratamento blebbistatin, desligue as bombas e carregue lentamente 0,2 a 0,3 mililitros de solução de corante de trabalho na superfície da fatia durante um período de 30 segundos. Após 90 segundos, ligue as bombas para lavar qualquer corante em excesso.
Depois de morrer a fatia com indicador de cálcio de estoque como apenas demonstrado, concentre as câmeras na fatia e acelere a fatia em um hertz com uma duração de largura de pulso de dois milissegundos a 1,5 vezes a amplitude do limiar de ritmo predeterminado. Coloque uma mancha sobre a fatia de tecido e ilumine a fatia com a fonte de luz de excitação led. Em seguida, registos emitidos de tensão e cálcio com as câmeras a 1.000 quadros por segundo.
Para condicionar os dados de mapeamento óptico de tensão e cálcio, no software de análise adequado, clique nos parâmetros de condição e remova o fundo. Em seguida, ajuste os parâmetros de condicionamento de sinal para obter o potencial de ação ideal e traços transitórios de cálcio. Para calcular a velocidade de condução, selecione o mapa de ativação e insira um tempo de início e fim para abranger um único potencial de ação no rastreamento.
Em seguida, clique no mapa regional e selecione a região de interesse para exibir o mapa de ativação da região selecionada. Em seguida, selecione o mapa de velocidade de condução e selecione os tempos de início e fim. Ajuste os valores de resolução entre pixels com base na configuração conforme necessário.
Clique em gerar mapa vetorial para selecionar uma região de interesse e exibir os vetores de velocidade de condução dentro dessa região. O desvio médio, mediano, padrão e o número de vetores incluídos na análise, bem como o ângulo médio de propagação dos vetores de velocidade de condução na região selecionada serão exibidos. Para calcular a duração potencial da ação, selecione a duração potencial da ação, o mapa de duração transitória do cálcio e selecione os tempos de início e fim para abranger um potencial de ação completo.
Em seguida, clique no cálculo de duração potencial da ação regional para selecionar uma região de interesse e gerar o mapa de duração potencial de ação. Para determinar o tempo de elevação, selecione o tempo de ascensão e selecione os tempos de início e fim para selecionar o upstroke de um único potencial de ação ou transitório de cálcio. Digite os valores percentuais de início e fim e clique em calcular para selecionar a região de interesse e determinar a média, mediana, desvio padrão e número de pixels incluídos na análise do tempo de elevação.
Para determinar a decomposição do cálcio, selecione a decomposição do cálcio e entre nos tempos de início e fim para abranger toda a porção de decomposição de um único sinal transitório de cálcio. Em seguida, clique em calcular tau para selecionar a região de interesse e determinar a média, mediana, desvio padrão e número de pixels incluídos na análise do tempo de decomposição de cálcio constante. Neste experimento representativo, o potencial de ação e os traços transitórios de cálcio foram condicionados ao sinal.
Os tempos de ativação foram determinados para cada pixel e mapas isocronais dos tempos de ativação foram traçados a partir da tensão condicional e traços de cálcio. Os vetores de velocidade de condução foram calculados usando os tempos de ativação e a conhecida resolução entre pixels. A constante de decomposição transitória de cálcio foi medida por encaixar um polinômio na porção em decomposição dos traços de cálcio.
A duração potencial da ação e a duração transitória do cálcio foram medida como a duração do tempo entre o tempo de ativação e um percentual especificado da re polarização ou remoção de cálcio do citoplasma, respectivamente. Os tempos de elevação dos traços de tensão e cálcio também foram medidos e mapeados. Nesta análise representativa, o efeito da doxorubicina na condução cardíaca foi testado resultando em uma redução da velocidade de condução transversal.
É importante ter certeza de que as fatias estão em parada cardioplégica completa para minimizar os danos ao tecido durante o procedimento de corte e obter fatias viáveis. No final do protocolo, as fatias podem ser congeladas ou fixadas para avaliação molecular. As vias mecanicistas envolvidas no fenômeno eletrofisiológico de interesse podem então ser determinadas.
O desenvolvimento desse modelo de fatia cardíaca humana permitiu o estudo das respostas aos tratamentos e doenças no tecido cardíaco humano, fazendo a ponte entre estudos animais e clínicos. Ao trabalhar com tecidos humanos durante a execução desta técnica, certifique-se de usar o EPI apropriado e tomar quaisquer outras precauções de segurança necessárias.
