Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de bolsas de Saúde 2R01 GM53132 e P50 GM071558.

1. Células de carga com indicadores de cálcio <ol><li> Células da placa de vidro em 35mm pratos fundo Mattek (ou qualquer outro fundo de vidro visualização câmaras). </li><li> Se estiver usando casaco de miócitos primário das câmaras de um dia antes com 10μg/ml laminina. Miócitos cardíacos placa (isoladas de cães adultos, ratos neonatal, ou outro organismo) em KB de buffer (K-reversão tampão Tyrode 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO 3, 2 mmol / L de MgCl 2 e 0,4 mmol / L de KH 2 PO 4, pH 7,5) e alterá-lo gradualmente a M199 meio suplementado com 15% de soro fetal bovino e 1% streptamycin e gentamicina 0,5% e incubar a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Incubar as células com cálcio verde AM (1-5 mM; Molecular Probes) ou qualquer outro indicador de cálcio desejado por 30-45 min em temperatura ambiente. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a fotodegradação do corante. </li><li> Lave as células três vezes com Leibovitz15 médio com 14mm EGTA (se a realização de experimentos em cálcio) ou qualquer outra mídia de visualização apropriada. </li><li> Incubar por mais 30-45 minutos em média Leibovitz15 containing14mM EGTA. </li><li> Se o teste efeitos de inibidores (ie 10μM U73122 PLC inibidor) adicioná-los durante a segunda incubação. </li></ol> 2. Células Microinjecting <ol><li> Cardiomiócitos de cultura em placas de vidro de fundo Mattek (ou outras câmaras de visualização) para 24h. </li><li> Mudança a médio e livre de fenol Leibovitz-15 com 14 mM EGTA (cardiomiócitos tem que ser injetado em cálcio meio livre, outras células podem ser injetadas em cálcio contendo meio). </li><li> Preparar a solução microinjeção - nossos estudos usaram um peptídeo que elimina Gα q - interações cavéolas. Tenha em mente que apenas uma pequena quantidade de volume é injetado na célula (~ fL) e assim por ações razoavelmente concentrada deve ser usado. Usamos 2 mM desse peptídeo, Cav3-scaffold, com DAPI em cálcio meio livre. DAPI é um blue que tinge o núcleo e permite a identificação de células que foram microinjeção. DAPI não interfere com a fluorescência dos indicadores de cálcio muitos. A quantidade de DAPI é variável e geralmente usamos o suficiente para visualizar o núcleo (0,5 e 2 mM) </li><li> Preparar a solução controle contendo DAPI - o traçador corante sozinho. </li><li> Microinjeções de usar agulhas auto-puxado ou disponíveis comercialmente. Prática com injeção de corante para determinar parâmetros de agulha apropriada. Notamos que diferentes células pode exigir diâmetros diferentes da agulha e pressões microinjeção. </li><li> Usar o sistema de microinjeção automatizado, por exemplo, um NI2 InjectMan com uma bomba FemtoJet de Eppendorf. Definir a injeção de pressão P i a 90 hPa, ea compensação de pressão P c a 45 hPa. Defina o tempo de injeção t para 0,7 s. Reajustar os parâmetros de injeção conforme a necessidade. </li><li> Executar microinjeções em um microscópio invertido (Zeiss por exemplo Axiovert 200M) equipado com longa distância trabalhando objetivo de contraste de fase (por exemplo, fase do ar 40x objectivo 2). </li><li> Injetar as células maior número possível de forma rápida. Examine células injetadas com o contraste de fase para selecionar células viáveis. </li></ol> 3. Co-imunofluorescência estudos <ol><li> Lave as células duas vezes com PBS e corrigir com paraformaldeído 3,7% por 30 minutos. Se necessário, as células podem ser estimulada antes da fixação. </li><li> Lave as células fixas três vezes com PBS e incubar com 0,2% NP40 em PBS por 5 minutos. </li><li> Bloco utilizando PBS contendo soro de cabra 4% (ou soro apropriado outros) para uma hora. </li><li> Incubar as células com o anticorpo primário na diluição adequada com soro de cabra 1% em PBS por 1 hora. </li><li> Lave as células três vezes durante 10 minutos com 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 seguido por adição de anticorpo marcado fluorescente-secundários, tais como Alexa-Fluor-488 anti-coelho ou Alexa-Fluor-647 anti-rato anticorpo secundário diluído a 1: 1000 1 soro de cabra% em PBS (note que quando o teste para duas proteínas diferentes os anticorpos primários devem ser levantadas em diferentes espécies e do secundário devem ser contra a espécie correspondente). </li><li> Incubar a 37 ° C por 1 hora, lavar três vezes com TBS. </li><li> Ver células em tampão TBS ou outro meio de visualização apropriada. </li></ol> 4. Imagem de cálcio rápido <ol><li> Use de varredura a laser microscópio confocal (por exemplo FluoView 1000 Olympus). </li><li> Use objetivo alta abertura numérica. </li><li> Definir os parâmetros de aquisição. Para a excitação de cálcio verde nm use 488 e 515 filtros de passar muito tempo de emissão. </li><li> Ajustar o tempo de pixel - para medições rápidas de cálcio configurá-lo para a 2 microsiemens / pixel. </li><li> Definir o zoom da imagem para obter tamanho de pixel de ,05-0,3 mM. </li><li> Selecione uma linha de uma célula de escolha em uma determinada região. </li><li> Na janela de controlador de tempo de aquisição de tempo para selecionar pelo menos 1.500 exames (para obter desejado prazo dea resposta - 1.3 ms / linha renderia 2 segundos). </li><li> Fundo registre a leitura antes da estimulação. </li><li> Estimulam as células com 5 mM carbacol e imediatamente começar a gravação de dados. Manter as células em 1 ml de Leibovitz15 médio, prepare carbacol 10 mM em Leibovitz15 e adicione delicadamente mL 1 para o prato </li></ol> 5. A análise dos dados <ol><li> Extrair as intensidades para cada pixel da imagem gravada. Guardar os dados de intensidade como uma tabela utilizando software FluoView 1000. </li><li> Importar dados de intensidade em SigmaPlot ou um programa de análise de dados e similares bin os dados em ~ 90-40 caixas. Compare para controlar experimentos e ruídos eletrônicos. </li></ol> 6. Resultados representativos: Nós imaged células em microscópio confocal de varredura a laser LSM510 (Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com várias linhas de excitação laser e um 40x/1.2 Apochromat NA objetivo imersão em água. Na fig. 1 (vermelha), mostramos a repartição don da cavéolas em cardiomiócitos adultos canina ventricular que foram fixados e corados com um anticorpo para caveolina-3, que é a proteína estrutural importante, caveolar nestes nove células. Caveolina-3 foi immunolabelled com Alexa-647 e animado com a linha 633-nm de uma Ele: laser Ne. As imagens foram gravadas usando LP650 filtro de emissão nm. A distribuição de caveolina-3 foi comparada com a que foi Gα q immunolabeled com Alexa-488 (verde). Alexa-488 estava animado com a linha 488nm do laser Argon-ion ea imagem foi gravado utilizando filtro de 530nm de emissão BP505-. Nessas medidas co-localização, os dois fluoróforos foram animado de forma seqüencial usando aquisição de várias faixas. Este procedimento minimiza o canal de cross-talk. Análise de dados para co-localização foi realizada usando o software fornecido com AIM Zeiss LSM510 Meta. Como pode ser visto, as duas proteínas são colocalized. Para determinar como o acoplamento entre caveolina-3 e Gα <sub&gt; q afetam os sinais de cálcio, realizamos estudos de imagem de cálcio em um sistema de microscópio de varredura confocal a laser (FluoView, Olympus, Tokyo, Japan), acoplado a um microscópio invertido (IX70, Olympus), com uma objetiva de 40x (UPlanApo, Olympus, abertura numérica 1,3), embora essas medidas também podem ser realizadas sobre os sistemas de Zeis descrito acima. Para estas medições, as células foram carregadas com Ca 2 + Verde. Nós animado o corante com um laser de íon argônio 488nm e recolheu imagens através de um filtro de emissão LP515. Quadros de imagem foram coletadas em intervalos de 500 ms. Valores de intensidade para cada pixel foram extraídas com software Olympus e ImageJ. O modo de varredura de linha foi utilizado para análise quantitativa de mais rápido Ca 2 + transientes e Ca 2 + faíscas. O tamanho do pixel utilizado no presente estudo foi 0,1-0,3 mM. A taxa de linha de varredura, foi cerca de várias centenas de mS por linha. Na fig. 2, mostramos uma varredura de uma linha de Ca 2 + cardiomiócitos Green-carregados onde o pixel dtempo bem foi a 2 microsiemens, o tempo foi de 142 mS line. A imagem é composta de 1200 linhas. Cada linha do scan corresponde à flutuação de intensidade de Ca 2 + Verde consistindo de 71 pontos tomados em uma faixa de 142 mS, e pode ser usado como uma rápida leitura para fora para respostas de cálcio. Por exemplo, na fig. 3 mostramos o Ca 2 + atividade de uma única linha de um cardiomiócito individual, medida pelo Ca 2 + intensidade de fluorescência verde em função do tempo em segundos antes (em cima) e depois (inferior) a adição de 5 mM carbacol que aumenta o nível de Ca 2 + intracelular através Gα atividade q-PLCβ. Quando muitas linhas são em média, a estimulação carbacol produz um aumento de ~ 1,8 vezes na Ca 2 + intensidade Green. Devido a variações nas condições experimentais (temperatura ambiente, a energia laser, detector de resposta, as distribuições de corantes, etc), este aumento não pode ser visto em cadascans linha. Mesmo que os valores de intensidade (valores do eixo y) são semelhantes, é claro que o enredo carbacol estimulada no fundo tem picos muito mais amplo, correspondendo a níveis de cálcio mais sustentado, do que os picos de flutuação estreita visto antes estimulação. Este aumento relativo na ampliação e intensidade obscurece pequeno, oscilações mais lentas. Nosso objetivo é melhor discriminar entre estes diferentes tipos aparente de flutuações de cálcio. Outro exemplo destas flutuações de cálcio rápido é mostrado na figura. 4. O gráfico de cima mostra os dados de linha-prima para cardiomiócitos do ventrículo estimulado (vermelho) e uma média de 3 traços linha é mostrado em preto. Para determinar a medida em que essas flutuações de cálcio foram mediadas por Gα q - caveoline3 interações, nós microinjeção um peptídeo que desestabiliza caveolina-3 - interações Gα q (ie peptídeos Cav3) que elimina a mais Ca 2 + atual e esses dados são mostrados em azul(Nota-se que nós subtraídos 500 da Cav3 intensidades peptídeo para que os dois traços pode ser melhor percebido). Importamos as colunas de dados brutos de nossos arquivos excel em SigmaPlot (Jandel, Inc.) e realizou uma análise de histogramas. Nesta análise, o número de eventos está agrupado em igual número de caixas (caixas) para produzir um histograma. A largura do bin representa um intervalo de tempo iguais. As intensidades são inseridos no tempo diferentes liga para que a altura de uma caixa especial representa o número de vezes que a intensidade ocorre na janela de tempo particular. Uma vez que este tipo de análise só depende de coleta de dados na velocidade de varredura mesmo, muitos vestígios podem ser analisadas simultaneamente. Além disso, esta análise não é sensível a diferenças nos níveis de corante, potência do laser, etc, e ruídos eletrônicos e de fundo ocorre em escalas de tempo muito rápido e são vistas apenas nos primeiros 1-2 bins. O correspondente histograms dos dados brutos na fig. 4 são mostradas na parte inferior da página. O histograma para as células de controle são distribuídos por um grande número de caixas correspondente a uma ampla distribuição do tempo, conforme representado pela linha vermelha (a linha é para orientar o olho e nenhum modelo é assumido). Em contraste, as caixas para a resposta das células onde a interação Gα q-Cav3 foi interrompido pela peptídeo estão confinados a uma distribuição bin estreita sugerindo que a presença de peptídeo elimina fluxos de maior duração. Microinjeção de um peptídeo de controle que não interrompe Gα q-Cav3 produz um histograma semelhante a un injetaram células-8. Na fig. 5 comparamos as flutuações de intensidade rápida de Ca 2 + Verde em adultos cardiomiócitos do ventrículo canina (esquerda) e fresco, cardiomiócitos de ratos unstimulated neonatal que a falta cavéolas (direita). Aqui, os histogramas correspondentes da intensidade durante um período de três minutos foram binned<html> a 35 para visualizar os eventos mais lento de cálcio. Note-se que os cardiomiócitos neonatal mostrar flutuações rápido em uma base plana mostrando a falta de Ca 2 + lento atividade enquanto uma linha de base mais estruturada é visto para as células adultas. Essas diferenças são mais facilmente observadas nos histogramas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Figura 1. Imagens de cardiomiócitos adultos canina ventricular mostrando a distribuição dos Gα q immunolabeled com Alexa-488-488, onde Alexa foi animado com 488nm linha de laser de argônio-íon ea imagem foi gravado utilizando filtro de 530nm de emissão BP505-. No canto superior direito é a mesma imagem de visualização da localização de caveolina-3 immunolabeled com Alexa-647, animado com a linha 633-nm de uma Ele:. Ne laser e gravados utilizando LP650 nm de emissão de filtro A imagem mesclada, onde co-localização é visto em laranja é no canto inferior esquerdo com uma imagem ampliada para a direita. <html> &quot;Pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> Figura 2. Cálcio imagem de um dos cardiomiócitos ventriculares caninos adultos vivendo carregado com Ca 2 + Verde. A imagem foi tirada em um sistema confocal microscópio de varredura a laser com uma objetiva de 40x usando um laser de 488nm Argon ion e um filtro de emissão LP515. A imagem é composta de 1200 linhas, o pixel tempo de permanência foi a 2 microsiemens, eo tamanho do pixel foi de 0,1 mM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> Figura 3. Flutuações de intensidade TOP de um traço de uma linha de cardiomiócitos ventriculares caninos adultos vivendo carregado com Ca 2 + Verde e fotografado como descrito, e BOTTOM mesma célula estimulada pela adição de 5 mM carbacol. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. TOP Um exemplo de traços de uma linha de cardiomiócitos ventriculares caninos adultos vivendo carregado com Ca 2 + Verde (vermelho) tomadas mais de 180 ms, onde a média de 3 traços é mostrada como uma linha preta, e em comparação com uma célula que foi microinjeção com um peptídeo que perturba Gα q-caveolina 3 associação (vermelho), onde uma média de três traços é em preto. Notamos que subtraiu 400 contagens de intensidade a partir do menor conjunto de dados para fins de visualização. Os painéis inferiores são os histogramas correspondentes dos dados binned como descrito no texto, e onde o número bin é arbitrária ea contagem bin (ou simplesmente contar) corresponde à quantidade total de intensidade em que Bin particular. Notamos que as linhas de linha vermelha e azul desenhada no controle (esquerda) e (à direita) peptídeo histogramas são para permitir uma identificação mais fácil e as comparações dos dados e nenhum modelo é assumido. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Flutuações de intensidade de Ca 2 + Verde em adultos cardiomiócitos do ventrículo canina (esquerda) e fresco, cardiomiócitos de ratos unstimulated neonatal que a falta cavéolas (direita) e seus histogramas correspondentes são mostrados abaixo.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós desenvolvemos um método para ver e isolar sinais de cálcio em cardiomiócitos rápida vivos. Enquanto as condições experimentais dessas medidas tenham sido previamente aplicado a sistemas de células de outros 10, assim como cardiomiócitos 11, o uso de histogramas e análise bin permite que dados de Ca 2 + muitos eventos a serem adquiridos. Eventos mais rápidos podem ser facilmente isoladas de mais lentas e modelos adaptados para compreender seus mecanismos subjacentes. Cardio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomiócitos ter vários fluxos de Ca 2 + de duração variável que trabalham em conjunto para otimizar 1,2 função. Mudanças na atividade Ca 2 + em resposta a agentes extracelular é normalmente regulada pela fosfolipase caminho q Cβ-Gα localizada na membrana plasmática, que é estimulado por agentes como a acetilcolina 3,4. Nós temos encontrado recentemente que os domínios membrana plasmática proteína chamada cavéolas 5,6 pode prender ativado Gα q 7. Esta armadilha tem o efeito de estabilizar o estado de ativação de Gα q e resultando em prolongada Ca 2 + sinais em cardiomiócitos e outros tipos de células 8. Descobrimos este resultado surpreendente, medindo as respostas dinâmicas de cálcio em uma escala rápida em cardiomiócitos vida. Resumidamente, as células são carregados com uma fluorescente indicador Ca + 2. Em nossos estudos, utilizamos Ca 2 + Verde (Invitrogen, Inc.), que apresenta um aumento na intensidade de emissão de fluorescência mediante ligação de íons de cálcio. A intensidade de fluorescência é então gravado para usar um modo de linha de varredura de um microscópio confocal de varredura a laser. Este método permite a aquisição rápida do curso de tempo da intensidade de fluorescência em pixels ao longo de uma linha selecionada, produzindo centenas de vestígios do tempo na escala de tempo de microsegundos. Esses traços muito rápidos são transferidos para excel e depois em SigmaPlot para análise, e são comparados aos vestígios obtidos para ruído eletrônico, corante livre, e outros controles. Para dissecar Ca 2 + respostas das taxas de fluxo diferentes, foi realizada uma análise de histograma que binned intensidades de pixels com o tempo. Binning permite-nos agrupar mais de 500 rastros de scans e visualizar os resultados compilados espacial e temporalmente em uma única parcela. Assim, a lenta Ca 2 + ondas que são difíceis de discernir quando os exames são sobrepostas, devido à colocação de pico diferente e ruído, pode ser facilmente visto emos histogramas binned. Fluxos muito rápido na escala de tempo da medição mostram uma estreita distribuição de intensidades nas caixas de tempo muito curto enquanto Ca 2 + mais ondas de mostrar dados binned com uma ampla distribuição ao longo escaninhos mais tempo. Essas distribuições de tempo diferentes nos permitem dissecar o momento de Ca 2 + fluxos nas células, e para determinar o seu impacto em vários eventos celulares.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Nós apresentamos um método para isolar rápido eventos (microssegundo) cálcio dos fluxos mais lento em células vivas usando laser microscopia confocal. O método mede as flutuações de intensidade de fluorescência de indicadores de cálcio através dos exames de gravação de linha de várias centenas de pixels em uma célula. Análise de histograma nos permite isolar as escalas de tempo de fluxos de cálcio diferentes.

Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.1K visualizações.  Queensborough Community College. Nós apresentamos um método para isolar rápido eventos (microssegundo) cálcio dos fluxos mais lento em células vivas usando laser microscopia confocal. O método mede as flutuações de intensidade de fluorescência de indicadores de cálcio através dos exames de gravação de linha de várias centenas de pixels em uma célula. Análise de histograma nos permite isolar as escalas de tempo de fluxos de cálcio diferentes.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.