Extração de Lumican da Membrana Amniótica e Determinação de sua Temperatura de Armazenamento

Este método visa demonstrar uma técnica simples para a extração de proteínas, útil para a obtenção de proteínas abundantes e outros fatores. Esta técnica poderia ser usada para extrair outros fatores e proteínas presentes na membrana amniótica e também, para obter proteínas de outras fontes, como animais e tecidos vegetais. Comece por descongelar 100 miligramas da membrana amniótica obtida do banco de amnónios.

Uma vez descongelado, adicione 10 mililitros da solução salina balanceada estéril a uma placa de Petri e lave a membrana por dois minutos. Em seguida, remova a solução salina balanceada usada em um copo e repita o processo até que nenhum vestígio de meio glicerol seja visível na placa de Petri. Em seguida, adicione 10 mililitros de dispase II à membrana e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos.

Ao final da incubação, realizar uma desepitelização mecânica com um raspador de cela de borracha policial. Em seguida, visualize a membrana sob um microscópio invertido para confirmar a desepitelização. Em seguida, lave a membrana amniótica desepitelizada com a solução salina balanceada estéril, como demonstrado anteriormente, e coloque-a em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Em seguida, mergulhe o tubo que contém a membrana em nitrogênio líquido por 40 minutos. Após o congelamento com nitrogênio líquido, moer manualmente a membrana por dois a três minutos em uma argamassa, pré-resfriada a menos 85 graus Celsius, até obter um pó fino. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de solução inibidora de protease e solubilize a membrana finamente pulverizada.

Limpe as paredes de argamassa com a ajuda de uma faca de bisturi e transfira a mistura para um tubo de cinco mililitros. Vórtice o tubo por 30 segundos. Em seguida, homogeneize a mistura de tecidos primeiro centrifugando a 34 G por 20 minutos a quatro graus Celsius, e imediatamente centrifugando-a novamente a 3.360 G por 20 minutos a quatro graus Celsius.

No final da centrifugação, colete o sobrenadante, que é o extrato da membrana amniótica, em um novo tubo. Em seguida, alíquota de 0,7 mililitros em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros diferente para vários pontos de tempo e temperaturas. A quantidade total de proteína e a concentração de lumicano no extrato de membrana amniótica foram afetadas pelo tempo e pelas condições de armazenamento.

A concentração de proteína basal foi semelhante entre todos os extratos de membrana amniótica. No entanto, uma concentração de proteína significativamente alta foi observada no extrato armazenado por 32 dias a quatro graus Celsius e 20 dias a menos 20 graus Celsius. O lúmican no extrato de membrana amniótica foi significativamente maior na amostra armazenada por um período de 12 dias em comparação com as amostras armazenadas por 30, 20 e seis dias a quatro e menos 20 graus Celsius.

Esses resultados sugeriram que o tempo e a temperatura de armazenamento apropriados para atingir a maior concentração de lumicano é de 12 dias a menos 20 graus Celsius. Exercite o máximo cuidado ao aterrar a membrana amniótica congelada. O aterramento deve ser suave, pois pode cair da argamassa.

Mais estudos são necessários para determinar o papel do extrato de membrana amniótica lumicano em células epiteliais da córnea e para determinar a dose ideal de lumicano para reepitelização corneana.