Os autores gostariam de agradecer a Emilie Josse pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela fundação "La Ligue contre le Cancer", a "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer", e o "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

1. Preparação de Grandes Vesículas Unilamellar (LUVs)
<ol><li>Prepare luvs para seu uso como mímica de membrana celular para ensaio de vazamento de fluorescência.</li>
	<li>Misture com uma fosfardolina de vidro Hamilton (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) e Colesterol (Chol, 386,65 g/mol) na razão molar 4:4:2. A solução lipídica é obtida a partir de uma solução de estoque de cada lipídio solubilizado em um solvente de fundo redondo de metanol/clorofórmio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL em um frasco de vidro de 25 mL de fundo redondo. Com base em 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM e 2 μmol de Chol, a solução lipídica é obtida a partir da solução de estoque misturando 126 μL, 117 μL e 31 μL, respectivamente. ATENÇÃO: O metanol é um solvente tóxico e inflamável e o clorofórmio é tóxico e cancerígeno. Ambos devem ser tratados com a proteção adequada sob um capô.</li>
	<li>Evaporar metanol/clorofórmio usando um evaporador rotativo sob vácuo durante 45-60 min a 60 °C até a formação de um filme lipídudo seco.</li>
	<li>Prepare duas soluções de buffer HEPES de estoque. Prepare o buffer HEPES 1 misturando HEPES de 20 mM (238,3 g/mol) e 75 mM NaCl (58,44 g/mol) e ajuste o pH para 7,4. Prepare o buffer HEPES 2 misturando HEPES de 20 mM e 145 mM NaCl e ajuste o pH para 7,4. Os buffers HEPES podem ser armazenados a 4 °C durante 1 mês. NOTA: Recomenda-se verificar a osmolaridade dos buffers usando um osmômetro.</li>
	<li>Prepare a solução de hidratação lipídica dissolvendo o casal fluorescente fluorescente de corante-quencher, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfônico ácido, sal dissudium a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e brometo p-xileno-bispiroriano a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) na solução tampão HEPES. Misturar ANTS com DPX leva a uma solução de cor amarela. Para alcançar as concentrações de 12,5 mM de ANTS e 45 mM de DPX, dissolva 21,4 mgs e 76 mgs, respectivamente em 4 mL de tampão HEPES 1. NOTA: A solução de hidratação lipídica pode ser armazenada por 2 semanas a 4 °C, enrolando o tubo com papel alumínio.</li>
	<li>Reconstituir vesículas multilamellar (MLV) reutilizando o filme lipídigo seco com 1 mL da solução de hidratação lipídica e por vórtice até a dissolução do filme lipídado seco. Certifique-se de que a solução seja completamente solubilizada, pois pequenos agregados lipíduos afetarão negativamente as etapas anteriores. Além disso, verifique a parede do frasco de fundo redondo de vidro para garantir que não haja filme lipídedo restante. NOTA: A solução aparecerá opalescente e amarela clara após a solubilização.</li>
	<li>Sujeitar as vesículas a cinco ciclos de congelamento/degelo para obter vesículas unilamellar. Realize cada ciclo colocando o frasco de fundo redondo de vidro por 30 s em nitrogênio líquido para congelar passo, em seguida, deixando-o em um banho de água por 2 minutos para o passo de descongelamento. NOTA: A temperatura da água do banho deve ser 5-10°C maior do que a temperatura de fusão dos lipídios.</li>
	<li>Prepare a extrusora lipídica inserindo dois suportes de filtro umidificados preliminarmente com tampão HEPES em cada peça extrusora de politetrafluoroetileno (PTFE) colocada no recipiente de extrusor metálico.</li>
	<li>Coloque uma membrana de policarbonato umidificado HEPES (tamanho de poros de 0,1 μm, 25 mm de diâmetro) na parte superior de um suporte de filtro.</li>
	<li>Monte os dois recipientes de extrusora de metal e enrosque-os.</li>
	<li>Coloque a extrusora montada no suporte e introduza uma seringa de 1 mL no orifício apropriado na extremidade de cada peça extrusora de politetrafluoroetileno. A extrusão corresponde à passagem do líquido testado de uma seringa para outra através da membrana de policarbonato.</li>
	<li>Teste a extrusora com 1 mL de tampão HEPES carregado em uma das seringas de 1 mL para garantir que não haja vazamentos ou problemas.</li>
	<li>Substitua o tampão HEPES de 1 mL com a amostra MLV.</li>
	<li>Realize a extrusão passando a amostra de MLV de uma seringa para outra através da membrana de policarbonato pelo menos 21 vezes para obter LUVs uniformes do mesmo tamanho. NOTA: A extrusão deve ser realizada a uma temperatura superior à temperatura de fusão da mistura lipídica.</li>
</ol>2. Purificação de LUVs
<ol><li>Prepare uma purificação de coluna para remover o excesso de ANTS e DPX não encapsulados.</li>
	<li>Introduzir gel dextran transversal (G-50) resuspendido em meio aquoso com 0,01% NaN3 (65 g/mol) em uma coluna de cromatografia líquida (Luer Lock, Sem jaqueta, 1,0 cm x 20 cm, volume de cama 16 mL) até 1 cm abaixo do topo da parte incolor da coluna.</li>
	<li>Abra a torneira e deixe o líquido fluir para liquidar o gel dextran transversal.</li>
	<li>Lave a coluna eluvando com 20 mL de buffer HEPES 2 e descarte o fluxo de saída da coluna.</li>
	<li>Feche a torneira assim que o volume morto de solvente acima da coluna for minimizado (<100 μL), mas suficiente para evitar qualquer secagem do gel de dextran transversal.</li>
	<li>Coloque os LUVs recém-extrudados (amarelo) na coluna e deixe-os entrar no gel de dextran transversalmente ligado.</li>
	<li>Adicione continuamente o buffer HEPES 2 à coluna para realizar a purificação do LUV.</li>
	<li>Elute aproximadamente 2 mL de tampão HEPES 2 (não se esqueça de encher regularmente a parte superior da coluna para evitar secar o gel dextran cross-linked): a solução amarela gratuita ANTS e DPX migra mais lentamente do que os lipossomos.</li>
	<li>Comece a coletar LUVs purificados em tubos (1,5 mL).</li>
	<li>Observe as gotas de eluent da coluna e quando elas se tornam opalescentes, contêm lipossomos. Altere o tubo para recuperar a fração que contém LUV.</li>
	<li>Elute até que as gotas não sejam mais opalescentes (~1 mL). Depois, elute mais 0,5 mL em uma fração separada e, em seguida, parar de eluia. NOTA: As normas estão agora disponíveis em uma ampla gama de pesos moleculares, como kits ou pesos moleculares individuais para calibrar o volume de eluição dos LUVs.</li>
	<li>Enrole os tubos com os LUVs em papel alumínio para evitar branqueamento do corante de fluorescência.</li>
	<li>Lave a coluna com 20 mL hepes tampão 2.</li>
	<li>Os LUVs podem ser armazenados por uma semana a 4 °C. NOTA: Como a estabilidade do LUV pode depender da concentração e composição do LUV, bem como da força iônica, o tamanho dos LUVs deve ser controlado usando um instrumento de dispersão dinâmica de luz (DLS) (ver seção 4). Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV) antes de cada teste.</li>
</ol>3. Quantificando a concentração de LUVs
<ol><li>Estime a concentração de LUV por um kit de quantificação fosfolipídida, que permite a avaliação da concentração de colina19. Este ensaio pode ser aplicado quando fosfolipídios com colina contendo cabeça polar são substanciais (>50% dos LUVs).</li>
	<li>Prepare o reagente de cor dissolvendo 18 mg de substrato de cromogênio em 3 mL de tampão fornecido.</li>
	<li>Carregue um cuvette de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, com 3 mL de reagente colorido.</li>
	<li>Use o reagente de cor pura como condição em branco (Em branco). Adicione 20 μL de amostra DE LUV (Teste) ou 20 μL de solução padrão de concentração de colina conhecida (Padrão).</li>
	<li>Misture bem e incubar por 5 min a 37 °C todas as condições (Branco, Teste e Padrão).</li>
	<li>Meça a absorvância (densidade óptica, OD) da amostra de ensaio e a solução padrão com a solução em branco como o controle a 600 nm com um espectrofotômetro.</li>
	<li>Verifique os valores de OD que permitem estimar a concentração lipídica dos LUVs, C[LUV], em equivalente à colina em comparação com o padrão de concentração conhecida.</li>
	<li>Realize o cálculo usando a seguinte equação: C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l) NOTA: O kit de quantificação fosfolipídida forneceu uma solução padrão de Cloreto de Colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL correspondente à concentração molar de C[Padrão] = 3,87 mmol/L. A amostra de OD e o Padrão OD são as absorvências medidas a 600 nm para as soluções LUV e Choline, respectivamente.</li>
</ol>4. Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV
<ol><li>Realize uma medição utilizando um instrumento DLS para determinar o tamanho do LUV (em nm) e o índice de polidispersidade (IDP).</li>
	<li>Programe o "procedimento de operação padrão" (SOP) apropriado, indicando a viscosidade do solvente/tampão e da cuvette usada.</li>
	<li>Coloque 500 μL da solução LUV em um cuvette semi-micro de poliestireno.</li>
	<li>Insira o póreno semi-micro cuvette em um instrumento DLS.</li>
	<li>À temperatura ambiente, meça a distribuição de tamanho em termos de tamanho médio (Z-média) da distribuição de partículas e de homogeneidade (índice de polidispersidade, IDP).</li>
	<li>Todos os resultados são obtidos a partir de duas medidas independentes realizadas cada uma em três ciclos repetitivos. NOTA: Os valores padrão para LUVs serão de 137 ± 7 nm com um ID ID de 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Preparação de soluções de peptídeos
<ol><li>Prepare uma solução de estoque do peptídeo, que deve ser analisada para o ensaio de vazamento.</li>
	<li>Dissolver o pó de peptídeo (>95% de pureza) em água pura (por exemplo, 1 mg de peptídeo em 500 μL de água pura). NOTA: Recomenda-se diluir peptídeos em água pura e evitar a solubilização de sulfóxido de dimetila (DMSO), que poderia induzir artefatos (por exemplo, permeabilização da membrana20).</li>
	<li>Vórtice a solução de peptídeo para 5 s.</li>
	<li>Sonicize a solução de peptídeo em um banho de sônica de água por 5 min e, em seguida, centrífuga por 5 min a 12.225 x g. Colete o supernatante para determinação de concentração.</li>
	<li>Meça a absorvência a 280 nm de três diluições de peptídeos independentes e, em seguida, calcule a concentração de peptídeo usando seu coeficiente de extinção molar ε (dependendo do conteúdo de triptofano e tyrosine na sequência de peptídeos) e regra beer-lambert. NOTA: Se o peptídeo contém triptofano e tyrosina, o coeficiente de extinção molar ε é computado com base em ε triptofano = 5.690 M-1cm-1 e Tyrosine ε = 1.280 M-1cm-1. Se a sequência de peptídeos não contiver triptofano ou tiranona, outro ensaio colorimétrico poderia ser realizado para medir a concentração (por exemplo, BCA ou Bradford).</li>
	<li>Diluir a solução de peptídeo em água pura para uma solução final de 100 μM e armazenar a 4 °C. NOTA: Em água pura, não ocorre degradação de peptídeo durante o armazenamento de 4 °C. No entanto, a concentração de peptídeos deve ser medida a cada 2 semanas para garantir que não ocorra evaporação da água.</li>
</ol>6. Ensaio de vazamento de fluorescência
<ol><li>O ensaio de vazamento de fluorescência é medido em um espectrofluorômetro à temperatura ambiente. Excitação e comprimento de onda de emissão são fixados em Ex = 360 nm ± 3 nm e Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.</li>
	<li>Diluir LUVs em 1 mL hepes tampão 2 a uma concentração final de 100 μM em um cuvette fluorescência de quartzo. Adicione um agitador magnético para homogeneizar a solução durante o experimento.</li>
	<li>Meça os LUVs sozinhos durante os primeiros 100 s, entre t = 0 s e t = 99 s para acessar a fluorescência de fundo. NOTA: Apenas luvs também poderiam ser medidos durante todo o experimento (15 min) a fim de acessar fluorescência de fundo e possíveis vazamentos.</li>
	<li>A partir daí, meça o vazamento como um aumento da intensidade da fluorescência após a adição de alíquotas de solução de peptídeo para os próximos 900 s (15 min). Este protocolo é realizado para cada concentração de peptídeo testado de 0,1 μM a 2,5 μM.</li>
	<li>Finalmente, 100% de fluorescência foi alcançado solubilizando os LUVs pela adição de 1 μL de Triton X-100 (0,1%, v/v), resultando na sonda completamente inconchada entre t = 1.000 s e t = 1.100 s.</li>
</ol>7. Quantificação do vazamento
<ol><li>Suprimir valores obtidos após t = 1.090 s, a fim de manter o mesmo número de pontos para cada condição testada.</li>
	<li>Calcule a fluorescência mínima, Fmin,fazendo a média de 50 pontos entre t = 0 s e t = 49 s (SOMENTE LUVs).</li>
	<li>Calcule a fluorescência máxima, Fmax,fazendo a média de 50 pontos entre t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUVs com Triton X-100).</li>
	<li>Calcule a porcentagem de vazamento (%Vazamento) em cada ponto de tempo (t = x), de acordo com a seguinte equação: %Vazamento(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Calcule o desvio médio e padrão dos valores obtidos com diferentes preparações de LUV (n ≥ 2) para a mesma condição.</li>
	<li>Plote a porcentagem de vazamento, %Leak(t=x), em função do tempo (s).</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

O ensaio de vazamento de fluorescência apresentado é um método simples e rápido para lidar com a desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células. Fácil de fazer, também permite uma comparação indireta entre diferentes peptídeos que interagem por membrana ou outras moléculas que interagem por membrana. Quanto às etapas críticas do protocolo, uma vez que este ensaio fornece valores relativos entre a linha de base (SOMENTE LUVs) e a liberação de fluorescência máxima (condição triton), g...

Após sua descoberta nos anos noventa, peptídeos penetrantes por células (CPPs) foram desenvolvidos para promover uma entrega celular eficiente de cargas através da membrana plasmática1,2. CpPs são geralmente peptídeos curtos, geralmente de 8 a 30 aminoácidos, tendo uma grande variedade de origens. Eles foram definidos pela primeira vez como portadores de "translocação direta", o que significa que eles foram capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para células independentemente de qualquer via endocítica, nem exigência de energia nem envolvimento receptor. No entanto, investigações posteriores revelaram que essas primeiras observações vieram principalmente da superestimação da fluorescência devido ao artefato experimental e/ou aos protocolos de fixação usando metanol3. Atualmente, é amplamente aceito que a captação de CPP ocorra tanto pela endocitose quanto pela translocação independente de energia4,5,6,7 dependendo de diferentes parâmetros como a natureza da carga, o elo utilizado entre CPP e carga, a linha celular estudada, etc.
As CPPs podem ser utilizadas como agentes de transfecção de acordo com duas estratégias, envolvendo uma ligação química (estratégia covalente) ou interações eletrostáticas/hidrofóbicas (estratégia não covalente) entre o CPP e sua carga8,9,10,11. Embora ambas as estratégias tenham demonstrado sua eficiência na transferência celular de várias cargas, o entendimento do mecanismo de internalização pelas CPPs ainda está sob controvérsia e o equilíbrio entre vias de endocitose ou penetração direta ainda é difícil de medir12,13. Embora um conjunto de ferramentas e estratégias experimentais estejam disponíveis para abordar claramente o envolvimento de processos endocíticos, a translocação direta parece, no entanto, mais difícil de caracterizar, pois implica interações mais discretas com componentes da membrana plasmática. As membranas biológicas são geralmente compostas de inúmeros componentes, desde fosfolipídios até proteínas de membrana, que podem variar de acordo com o tipo celular e/ou o ambiente (condições de estresse, divisão celular, etc.). Essa diversidade de composição e, consequentemente, a ausência de um modelo universal de membrana celular não permite estudos de uma única forma. No entanto, para contornar essas limitações, foram desenvolvidas abordagens passo a passo com extratos artificiais de membrana ou membrana. Desde pequenas vesículas unilamellar até abordagens de monocamadas, cada modelo era claramente pertinente para responder a perguntas específicas14,15. Entre elas, as grandes vesículas unilamellar (LUVs) constituem um modelo de imitação de membrana adequada para estudar as interações peptídeo/membrana como um ponto-chave no processo de internalização.
Neste contexto, o protocolo a seguir descreve a investigação dos efeitos dos peptídeos e interações peptídeo/membrana na integridade luvs através do monitoramento de um corante fluorescente aniônico e seu correspondente quencher poli-cártalico encapsulado em lipossomos. Esta ferramenta é usada para estudar interações CPP/membrana, a fim de entender se elas são capazes de realizar uma translocação direta de membrana. Embora geralmente aplicado para comparar diferentes peptídeos que interagem por membrana, este ensaio de vazamento de fluorescência LUV também pode ser usado para investigar tanto conjugados CPPs-carga (estratégia covalente) quanto complexos de carga CPP (estratégia não covalente).
O presente protocolo será, portanto, exemplificado pela primeira vez com o triptofano recentemente desenvolvido (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAP)16. O WRAP é capaz de formar nanopartículas baseadas em peptídeos para fornecer de forma rápida e eficiente RNA (siRNA) em várias linhas celulares16. As propriedades de vazamento de fluorescência apenas do peptídeo WRAP ou nanopartículas baseadas em WRAP carregadas de siRNA foram monitoradas para caracterizar seu mecanismo de internalização celular. Mostramos que seu mecanismo de internalização envolvia principalmente a translocação direta7. Em um segundo exemplo, o peptídeo WRAP foi covalentemente conjugado ao peptídeo de interfertídeo iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e sua capacidade de desestabilizar membranas foi comparada em um ensaio de vazamento de fluorescência ao iCAL36 acoplado à Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), outra CPP.
Por fim, serão discutidas as vantagens e limitações do método tanto do ponto de vista tecnológico quanto no que diz respeito à relevância biológica.

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&amp;nbsp;</td><td>WAKO&amp;nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &amp;micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&amp;nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são definidos como portadores capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para as células. Uma das principais características comuns necessárias para esta atividade resultou das interações de CPPs com a membrana plasmática (lipídios) e mais particularmente com componentes da matriz extracelular da própria membrana (sulfato heparan). De fato, independente da translocação direta ou da internalização dependente da endócita, bicamadas lipídicas estão envolvidas no processo de internalização tanto no nível da membrana plasmática quanto no nível de tráfego intracelular (vesículas endossomais). Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo as diferentes etapas de uma grande formulação de vesículas unilamellar (LUVs) formulação, purificação, caracterização e aplicação no ensaio de vazamento de fluorescência, a fim de detectar possível desestabilização/interação da membrana CPP e abordar seu papel no mecanismo de internalização. LUVs com uma composição lipídica refletindo o teor da membrana plasmática são gerados a fim de encapsular tanto um corante fluorescente quanto um saciador. A adição de peptídeos no meio extravesicular e a indução de interações peptídeo-membrana nos LUVs podem, assim, induzir de forma dependente de dose um aumento significativo da fluorescência revelando um vazamento. Exemplos são fornecidos aqui com o recém-desenvolvido triptofano (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAPs), que mostraram uma entrega rápida e eficiente de siRNA em várias linhas celulares. Finalmente, discute-se a natureza dessas interações e a afinidade com os lipídios para entender e melhorar a translocação da membrana e/ou a fuga endossomal.

O princípio do ensaio de vazamento de fluorescência é mostrado na Figura 1. Em detalhes, grandes vesículas unilamellar (LUVs) encapsulando um corante fluorescente e um quencher (sem sinal de fluorescência) são tratados com a biomolécula de interesse. Devido à interação do peptídeo com membranas lipídicas, o que pode implicar permeabilidade da membrana, reorganização ou até mesmo ruptura, o corante de fluorescência e o saciador são liberados d...

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.2K visualizações.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Vídeo: Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Química

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Imunologia e Infecção

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Biologia

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Source: Guo, L. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Ensaio de perseguição de cicloheximida baseado em microplacas de fluorescência: uma técnica para monitorar a cinética de degradação de proteínas fluorescentes nucleares mal dobradas

Source: Guo, L. et. al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

Técnicas de Ensaio

Ensaios bioquímicos

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Um ensaio de clivagem de peptídeos fluorogênicos para rastrear a atividade proteolítica de proteases

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

Imunologia

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Source: Konate, K. et al. <a href="https://app.jove.com/v/62028">Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics &#8212; large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Ensaio de vazamento de fluorescência para estudar a interação do peptídeo que penetra nas células com a membrana

Source: Konate, K. et al. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (2020)
This video ...