Os autores gostariam de agradecer a Fundação Baker e &#39;Mulheres na Ciência Fellowship »do Royal Children Foundation apoio de Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty e Edouard G. Stanley são NHMRC Senior Bolseiros de Investigação. Trabalho em seus laboratórios foi apoiada por NHMRC e Células-Tronco Austrália.

Declaração de Ética: A aprovação ética para a recolha de tecidos e malformação prepúcio linfáticos foi obtido a partir de Comitês de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital do Royal Children, Melbourne, Austrália. Consentimento assinado foi recebido de pais dos pacientes antes da cirurgia. As amostras de tecidos foram coletadas de pacientes com diagnóstico de LMs submetidos a procedimentos cirúrgicos, como parte de sua gestão clínica e os pacientes submetidos a circuncisão eletivo. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho de Investigação Médica Nacional de Saúde e, na Austrália. 1. Preparação de suspensão de células de prepúcio e malformação linfática Tecidos <ol><li> Buffers e Preparação de Mídia. <ol><li> Prepare a mídia de células endoteliais completo utilizando comercialmente disponível EGM-2 MV Kit bala pelo aquecimento EGM-2 media e gentilmente descongelar os componentes do kit em 37 ° C banho de água. Na classe II gabinete de biossegurança, de forma assépticaadicionar cada componente para os EGM-2 media. Uma vez que todos os componentes são adicionados aos meios de comunicação, consulte esta mídia como &#39;media de células endoteliais completo&#39;. Use estéril 50 ml de pipeta para misturar o conteúdo antes da utilização. NOTA: Todas as etapas referentes à cultura de células são realizadas em um armário de risco biológico classe II. Todas as soluções são armazenadas a 4 ° C de acordo com as instruções dos fabricantes e são aquecidos à temperatura ambiente antes de usar. Os meios completos de células endoteliais, tampões de cultura de células e soluções enzimáticas são aquecidos a 37 ° C durante 20 min antes da utilização. </li><li> Suplemento de meio completo de células endoteliais com 50 ng ml de VEGF-C /. Alíquota o meio celular endotelial suplementado em tubos de 50 ml estéreis e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. Os meios de comunicação é estável durante pelo menos 4 semanas, quando armazenado a 4 ° C. </li><li> Prepare de cálcio e magnésio livre salina tamponada com fosfato (PBS) por dissolução de 8,752 g de NaCl, 1,416 g de Na 2 HPO 4 .2H 2 O e0,395 g de KH 2 PO 4, em 1000 ml de água. Ajustar o pH para 7,4. Filtrar esterilizar PBS utilizando filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. Antes da utilização adicionar solução de antibiótico / antimicótico (utilizada a 1: 100). </li><li> Para preparar a fibronectina humana, dissolver 1 mg de fibronectina em 10 ml de água estéril. Loja solução em alíquotas de 100 uL a -20 ° reconstituído C. No dia da utilização, adicionar 10 ml de PBS estéril para 100 ul de fibronectina alíquota (para dar uma concentração de trabalho final de 10 ug / mL). </li><li> Para os meios de enzimas, preparar uma solução contendo 0,04% de Dispase II, 0,25% de colagenase II e 0,01% de DNase I em PBS estéril. Em primeiro lugar, pesam dispase e colagenase, lugar num tubo estéril de 50 ml, adicionar o volume necessário de PBS e incubar durante 30 minutos com agitação a 37 ° C para dissolver. Uma vez dissolvido, Esterilizar por filtração (filtro de 0,22 nm) de solução de dispase / colagenase na capa biosegurança. Adicionar assepticamente a ADNase I. loja a solução enzimática a 37 ° C atéusar. NOTA: ADNase I é um reagente de qualidade de cultura de células comercialmente disponível como pó liofilizado estéril. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de suspensão de células de prepúcio e Linfáticas Malformações <ol><li> Pesar um tubo de 50 ml contendo 10 ml de DMEM / 2% de solução de antibiótico antimicótico. Este tubo irá ser utilizado para a recolha de tecido. </li><li> A seguir à remoção cirúrgica da malformação linfático e tecidos de prepúcio, assepticamente adicionar amostra de tecido para o tubo em gelo e transferência para o laboratório de cultura de células. </li><li> Pesa-se o tubo contendo o tecido e calcular o peso do tecido. Use este peso para calcular o volume de solução enzimática necessária para digerir o tecido. </li><li> Em uma cabine de segurança biológica Classe II, use uma pinça estéril para transferir o tecido e mídia em um 100 milímetros prato de cultura de tecidos. Use uma tesoura esterilizada para picar finamente o tecido em ~ 1 mm3 peças. </li><li> Transferência de tecido picada misturada com i medianpara um tubo de 50 ml contendo um adicional de 10 ml de 2% de solução estéril antimicótico DMEM / antibiótico. Misture por inversão para voltar a suspender o tecido. Centrifugar a amostra a 300 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante. Com base no peso do tecido, adicionar 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) a colagenase II / solução de digestão com DNase I / Dispase II por 100 mg de tecido moído. Geralmente, utilizar 10 ml da solução de enzima para cerca de 1 g de tecido moído. </li><li> Incubar o tecido num banho a 37 ° C incubadora durante 20-90 minutos com agitação constante a 200 rpm. No final deste período, garantir que quase todo o tecido é digerido em fragmentos finos. NOTA: A exposição das células à colagenase e dispase na altura do isolamento da sobrevivência das células dos tecidos influências primário. Temos encontrado empiricamente que a maioria das amostras de prepúcio neonatal optimamente exigem 20-30 min de digestão, ao passo que as amostras malformação linfática fibróticas podem necessitar de 60-90 min de digestão. Rendimento LEC LMs são influenciados pela quantidade de fibrose presente, produzindo mais tecido fibroso menos células, possivelmente devido aos efeitos deletérios da exposição prolongada a colagenase e dispase II II. </li><li> Após a digestão, transferir o tubo para o cabine de segurança biológica e passar a solução tecido digerido através de uma peneira de 70 um colocado num tubo estéril de 50 ml. Usando 3 ml pistão seringas com um êmbolo de borracha, triturar o tecido remanescente até que são observados apenas pequenos vestígios de matriz extracelular. </li><li> Lavar o filtro de células com um volume de célula endotelial forma equivalente ao volume médio de dissociação da enzima para recuperar as células aderiram a peneira e para inactivar as enzimas. Por exemplo, para 2 ml de meio de dissociação da enzima para digerir o tecido moído, adicionar 2 ml de meio de células endoteliais para inactivar as enzimas. </li><li> Centrifugar a solução de células a 300 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. R&gt; e-suspender as células em 10 ml de PBS. Centrifugar células a 300 xgdurante 5 minutos, remover o sobrenadante em seguida, repita lavagem de células duas vezes. &gt; Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de meio de células endoteliais. Contar as células utilizando azul de tripano, em seguida, as sementes 2 x 10&gt; 6 células em 150 centímetros&gt; 2 balão pré-revestidos com fibronectina em um volume final de 20 ml de meio de células endoteliais. Cultura a 37 ° C em 5% de CO&gt; 2 na incubadora de ar humidificado.&gt; NOTA: Espera-se que 75% -90% de células nucleadas sobreviver digestão do tecido, tal como estimado por exclusão de azul de tripano. A contagem de células inicial reflecte todas as células nucleadas na suspensão de células (isto é, queratinócitos, leucócitos, macrófagos, células do tecido conjuntivo e das células dos vasos sanguíneos). A contagem de células em 5-7 dias reflete células que têm anexos, sobreviveram e proliferaram durante a cultura de células. Revestimento de tecido frascos de cultura com fibronectina também melhora LEC subseqüente e LM LEC sobrevivência. </li><li> Após incubação durante a noite, lavar as células não ligadas distância em três lavagens com PSolução de antibiótico-antimicótico BS / 1% e adicionar meio fresco de células endoteliais. Realizar três lavagens para remover eficazmente as células não ligadas e células vermelhas do sangue presentes no balão. Mudança de mídia a cada segundo dia. As células vão ser ~ 80% confluentes após 5-7 dias. </li></ol> 3. Coloração de anticorpos de células endoteliais para Linfática marcadores da superfície celular para citometria de fluxo <ol><li> Depois que as células atingiram 80% de confluência, médio aspirado e as células de lavagem com PBS. </li><li> Separe as células aderentes por incubação de células com 7 ml de solução de separação celular tal como Accutase por 150 centímetros 2 balão durante 5-7 min a 37 ° C. </li><li> Células colheita individual, inactivar a solução separação celular por adição de 3 volumes de meio de células endoteliais e transferir a suspensão de células para um novo tubo de ensaio estéril. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em 5 ml de PBS. Centrifugar células a 300 xg durante 5 minutos, retire as supernatant repita lavagem celular. Re-suspender as células em 5 ml de PBS. </li><li> Contar o número de células viáveis. Misturar 10 ul de suspensão celular com 90 ul de 0,4% de azul de tripano. Transferem-se 10 ul desta suspensão de hemocitómetro para contagem. NOTA: O rendimento celular final dependerá do tamanho da amostra processada. O rendimento celular habitual por 150 intervalos de 2 cm do balão a partir de 7 x 10 5-1,2 x 10 6 de células viáveis. </li><li> Preparar as soluções de anticorpo para coloração de células. NOTA: As seguintes diluições foram titulados para a coloração de 1 x 10 6 num volume de 100 ul de coloração. <ol><li> Dilui-PE anti-humano de ratinho conjugado VEGFR-3 (1:50); PE-Cy7 rato conjugado com CD34 anti-humano conjugado (1: 200); APC-rato conjugado CD31 anti-humano (1: 100) e Alexa 488-rato conjugado anti-humano podoplanin (1: 200) num volume total de 100 ul de solução estéril a 5% de FBS / PBS por amostra de tecido. Após a preparação desolução de anticorpo, manter em gelo até à utilização. Da mesma forma preparar mistura de anticorpo de controlo de isotipo diluído para facilitar a configuração de citometria de fluxo portões. </li></ol></li><li> Para reduzir a ligação não específica dos anticorpos, as células de centrifugação a 300 xg durante 2 min, em seguida, remover o sobrenadante suspender as células em 100 ul estéril 5% de FBS / solução de PBS por amostra a ser coradas. Incubar as células em gelo durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Células centrifugar a 300 xg durante 5 min, em seguida, remover o sobrenadante as células na mistura de anticorpos conjugados com re-suspender. Também manchar uma alíquota menor de células (1 x 10 5) em 100 ul de mistura de anticorpo de controlo de isotipo. Incubar as células em gelo durante 20 min. </li><li> Para remover o anticorpo não ligado, adicionar 2 ml de solução de 2% de FBS / PBS e centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e repetir a lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento celular durante o controlo de isotipo e o anticorpo corados amostra a ser classificados em 300 ul de 0,5 mg / ml de propídio iodide / 2% solução de FBS / PBS. Coloque tubos em gelo até a classificação. </li></ol> 4. celular Seleção <ol><li> Utilize os seguintes materiais para configurar o instrumento; grânulos de alinhamento, tais como partículas disponíveis comercialmente fluorescentes, com base salina do fluido do invólucro tampão fosfato e contas de atraso gota, tais como partículas fluorescentes Accudrop. </li><li> Isolar os LECs humanos purificados sobre um instrumento de triagem de células activadas por fluorescência de múltiplos parâmetros. Configure o instrumento e alinhar conforme as recomendações do fabricante. Além disso, executar os controles individuais de compensação mancha com cada espécie para gerar a matriz de compensação e eliminar, assim, sangramento substancial através da emissão de fluorocromos tais como PE no canal PE-Cy. NOTA: A maior parte das células separadas por FACS sobreviver ao isolamento se um bocal de 100 um é utilizado e as células são separadas em meio de células endoteliais. </li></ol> 5. Cultura Celular Pós FACS Ordenaring <ol><li> Na sequência de ordenação, centrifugar células a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5-10 ml de meio (dependendo do frasco utilizado para semear a célula). Se menos do que 50.000 células são classificadas, as células são cultivadas em fibronectina revestido frasco de 25cm 2. </li><li> Caso contrário, as células de cultura em balão revestido 2-fibronectina 75 centímetros a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2, incubadora humidificada de ar. Mudar mídia após 2 dias. NOTA: meios de comunicação celular é trocado a cada segundo dia, porque o prolongamento do tempo entre as mudanças de suporte parece favorecer a sobrevivência das células não endoteliais. Nós validar o fenótipo da célula endotelial linfático usando detecção imunohistoquímica de marcadores: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 e CD31 quando as células são de primeira divisão para uma maior expansão 15. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

LECs desempenhar um papel importante na manutenção da homeostase dos fluidos, resposta imunitária a antigénios estranhos e a absorção e transporte de alguns nutrientes. Homeostase LEC pode ser afectada por processos de doenças, tais como infecções bacterianas e metástases de tumores, mas também pode desenvolver LECs mutações somáticas que resultam na formação de vasos linfáticos disfuncionais e morbidade significativa para os pacientes afectados. Para ganhar mais compreensão da etiologia malformação ...

Uma das principais funções do sistema vascular linfático é absorver linfa, um excesso de fluido intersticial que contém lipídeos, proteínas e componentes celulares, e conduzi-la para o sistema venoso do sangue. Uma rede de capilares linfáticos dirige linfa para os nódulos linfáticos onde é rastreada quanto à presença de antigenes estranhos, um processo importante na vigilância e implantação de células brancas do sangue para neutralizar os antigénios estranhos imune. O sistema linfático unidireccional começa em tecidos com o capilar linfático inicial, uma estrutura única, com uma única camada descontínua de células endoteliais planas de parede fina com junções de células especializadas que permitem a entrada de linfa 1,2. Estes capilares estão ligados à matriz do tecido conjuntivo vizinho através filamentos de ancoragem para prevenir o colapso navio em presença de um aumento da pressão intersticial 3. Os capilares linfáticos iniciais vazios para recolha de capilares linfáticosque se aglutinam em vasos linfáticos maiores ou veias. Em comparação com o inicial vasos capilares linfáticos, recolha de vasos linfáticos têm paredes mais espessas, válvulas dos vasos linfáticos e emparelhados são revestidos por uma membrana basal descontínua em que algumas células de músculo liso são incorporados 4. Coordenada abertura e fecho de válvulas linfáticos e contracção de células musculares lisas facilita o fluxo de linfa 3. Nos seres humanos, os vasos linfáticos de várias regiões do corpo se juntam para formar troncos linfáticos que se fundem para formar dois canais linfáticos: o ducto torácico e ducto linfático direito. O ducto torácico drena a linfa do lado esquerdo do corpo e do lado direito abaixo do peito, enquanto o duto linfático drena a linfa desde o braço direito e no lado direito da cabeça, pescoço e tórax. Ambas as condutas conduzir linfa nas veias subclávia no pescoço 5. Desordens do sistema linfático são agrupadas em uma adquiridaND congénita (Tabela 1). Exemplos de condições adquiridas são linfangite e linfedema secundário. Linfangite é uma inflamação de um vaso linfático devido a uma infecção bacteriana. Os vasos linfáticos afetados dilatar e encher com exsudado contendo células polimorfonucleares. Na pele, estes vasos linfáticos são visíveis como faixas vermelha subcutânea, dolorosa muitas vezes acompanhada por alargamento do nó de linfa de drenagem associada (linfadenite) 6. Linfedema secundário surge como consequência de danos ou obstrução do vaso ou linfonodo obstrução linfática. Isto leva ao inchaço crônica progressiva devido ao acúmulo de linfa distal ao dano ou obstrução. Nos países desenvolvidos, linfedema secundário é mais comumente associado com a malignidade onde tumores metastasizing obstruir vasos linfáticos ou linfonodos regionais, ou como consequência da terapia anti-câncer após a remoção cirúrgica dos gânglios linfáticos, fibrose pós-irradiação e Throm pós-inflamatóriaBosis e cicatrizes 7. Em outras partes do mundo, linfedema secundário pode ser secundária à obstrução linfática causada por vermes parasitas, tais como Wuchereria bancrofti 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Distúrbios do sistema vascular linfático </td></tr><tr><td> Adquirido </td><td colspan="3"> Congênito </td></tr><tr><td rowspan="3"> Linfadenite Linfedema secundário </td><td> Linfedema Primário 10 </td><td> Esporádicos linfáticos Malformações 13 </td><td> Linfático malformações associadas a síndromes 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> por exemplo, Síndrome de Milroy Síndrome de Meige </td><td> Simples: As malformações linfáticas </td><td rowspan="2"> por exemplo, Síndrome de Klippel-Tranaunay Weber Parques Síndrome de Sturge-Weber </td></tr><tr><td> Combinado: Malformações capilares linfático- Malformação capilar-linfático-venosa Malformação capilar-linfático-artério Capilar-linfático malformação arteriovenosa venosa- </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Visão geral das desordens do sistema vascular linfático. Doenças congênitas do sistema linfático incluem primária (idiopática) linfedema pensado para ser causado por mutações genéticas, lymphangiectasia e anomalias do sistema linfático 8,9. Linfedema primário pode ser esporádica, presumivelmente causada por mutações de novo, ou herdado. Desordens linfáticas também pode ser isolado ou compreendem parte de uma síndrome mais generalizada 10. Na população pediátrica, 97% da linfaedema é esporádica com anormalidades na estrutura de vasos linfáticos que prejudicam a drenagem linfática regional de 11. Doença de Milroy é um exemplo de linfedema primário causada por uma mutação no gene do VEGFR-3 no momento do nascimento ou evidentes logo após 12. Embora na maior parte condição familiar, doença de Milroy, também podem ser identificados em lactentes sem história familiar de doença de Milroy 32. A gravidade de qualquer linfedema é dependente da quantidade de produção de linfa e capacidade de transporte da linfa de volta para a circulação venosa 6. Com base na apresentação clínica e na proliferação de células endoteliais situ, anomalias do sistema linfático são classificados como tumores linfáticos ou malformações linfáticas 13. Kaposiforme linfoangiomatose é um exemplo de um tumor LEC 14. As malformações linfáticas são pensados ​​para surgem durante o desenvolvimento embrionário e crescer em proporção à criança 15,16. Eles raramente regridem, mas pode remain assintomática até trauma ou infecção precipita crescimento rápido levando a complicações clínicas. A estrutura ordenada da rede linfática e condução da linfa do tecido a circulação venosa descrito acima é perturbado em malformações linfáticas que consistem em coleções localizadas de estruturas císticas anormais cheias de líquido linfático. Embora não haja evidência clínica ou experimental que estes vasos císticas são ligados à circulação linfática ou que eles contêm válvulas linfáticos funcionais, a sua identidade linfático é confirmada por expressão de gama de marcadores de células linfáticas, como podoplanin, CD31, linfática Veículo Endotelial Receptor 1 (LYVE-1), proteína homeobox Prospero 1 (PROX-1) e VEGFR-3 15,17,18. Estas estruturas císticos pode ser pequena (microcístico) ou grande (macrocísticos), mas a maioria das malformações linfáticas conter tanto microcístico e macrocísticas componentes (Figura 1) 16. Após a cirurgia, injection escleroterapia e / ou ablação por radiofreqüência as malformações linfáticas muitas vezes reaparecer. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Morfologia dos vasos linfáticos humanos e malformações linfáticas. Linfático humano normal (A) e vasos linfáticos malformação (B e C) marcados com o anticorpo para podoplanin (etiqueta castanho, seta). Vasos linfáticos humanos malformação são caracterizadas por acentuada dilatação e uma considerável variação no tamanho do lúmen. Estas estruturas anormais císticas localizadas pode ser pequena (microcístico, *) (B) ou grande (macrocísticos, #) (C). A maioria das malformações linfáticas conter ambos os componentes microcísticas e macrocísticas. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.</a> &lt;/ P&gt; Alguns pesquisadores sugeriram que as malformações linfáticas representam um transtorno do desenvolvimento da vasculatura linfática em que os LECs não tem potencial de crescimento anormal, mas em vez disso não conseguiram se conectar à circulação normal 19. No entanto, verificou-se que os LECs LM proliferar mais rapidamente e são mais resistentes à apoptose de prepúcio LECs 15 sugerindo que existe um defeito primário na LM LECs. Quando LM LECs são implantadas em um rato modelo de xenotransplante, eles formam estruturas que lembram malformações linfáticas 15. Isto suporta a hipótese de que as malformações linfáticas pode ser causada por uma ou mais mutações somáticas que surgem no LM LECs durante o desenvolvimento fetal. De facto, relatórios recentes identificaram uma tal mutação na subunidade catalítica de p110α (PIK3CA) gene 20-Quinase Phosphoinositide-3. Tendo em conta os avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA, mutações relevantes cOuld ser mais facilmente identificadas em isolados LM LECs, orientando futuros estudos sobre essas condições. O isolamento de LECs viáveis ​​seria facilitar as comparações entre LECs anormais e normais em ensaios, tais como a migração, proliferação, capacidade tubo de formação e sobrevivência em resposta à reduzida disponibilidade de nutrientes ou agentes pró-apoptóticos 15. Isolado LECs iria mais permitir-nos de realizar a expressão de genes específicos de células e estudos de proteômica, para delinear novas subpopulações LEC e descobrir novos agentes farmacológicos adequados para o manejo clínico de malformações linfáticas. Nós já publicou um método de isolamento LEC com base na separação magnética talão de LECs de prepúcio neonatal e malformações linfáticas 15. Nós relatou uma estratégia de separar LECs normais e doentes a partir de células endoteliais vasculares com base na ausência de expressão CD34, seguida por sujeição fração de células CD34 Neg a selecção positiva para CD31.No entanto, este método foi prejudicado pela presença de células não endoteliais residuais. Isto foi independente da epiderme remoção antes da digestão posterior do tecido conjuntivo. Estes contaminantes geralmente proliferam mais rapidamente e, assim, eventualmente overgrew as culturas de células endoteliais, apesar das tentativas posteriores de repetir LEC isolamento. Com efeito, uma inicial de contaminação de células não endoteliais tão baixas como 2% a 5% era suficiente para submergir a população LEC 15. Isto levou-nos a explorar método separação de células activadas por fluorescência como uma opção para melhorar o rendimento das células LEC e pureza. Além disso, utilizou-se vários parâmetros de classificação para aumentar a especificidade das populações LEC, a adição de VEGFR-3 e podoplanin para os marcadores de selecção para identificar CD34 CD31 de baixo Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LECs. A justificativa para selecionar esses marcadores baseou-se nos relatórios que enquanto ce LECs e vascular endotelial sangueLLS tem muitos marcadores da superfície celular em comum, tais como CD31, LECs mostrar variação fenotípica em sua expressão de CD34, podoplanin e VEGFR-3 marcador da superfície celular quando comparado ao sangue células endoteliais vasculares 21-23. CD31 é uma glicoproteína transmembranar de 130 kDa, também conhecido como molécula de adesão de plaquetas de células endoteliais 1 (PECAM-1). Ele é considerado como um marcador celular pan-endotelial, uma vez que é expresso em todos os tipos de vasos sanguíneos e linfáticos 21,24,25. CD34 é 110 kDa transmembranar da glicoproteína presente em células progenitoras hematopoiéticas e mais células estaminais, células endoteliais vasculares e alguns vasos linfáticos 26. VEGFR-3, o receptor para os factores de crescimento vascular endotelial C e D, é inicialmente presente nas veias do embrião de rato em desenvolvimento, mas seguinte especificação linfático regulada por factores de transcrição HMG-box relacionada-SRY (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor 2 (COUPTF-II) e PROX-1, VEGFR-3 expressão venosa está perdido e torna-se restrita a embrionária LECs 25,27. Podoplanin, uma membrana de 38 kDa mucoproteína, é observado pela primeira vez em vasos linfáticos em cerca de 11 dias embrionários (~) de rato E11.0 desenvolvimento embrionário 28 e enquanto ele é fortemente expresso por vasos linfáticos microvasculares, podoplanina por endotélio linfático macrocístico em malformações linfáticas é mais variável 15. A citometria de fluxo experiências sugerem que pelo menos algumas células endoteliais CD34 CD31 alta Pos expressar o marcador linfático podoplanin 29. Embora a avaliação sistemática de coloração LYVE-1 e podoplanin em malformações linfáticos humanos mostrou que ambos são eficazes na coloração malformação endotélio linfático 30, em tecidos normais, LYVE-1 foi relatada como sendo fortemente presente na linfático inicialendotélio capilar, mas reduzida e até mesmo ausente no endotélio linfático coleta 31. Como nosso objetivo é isolar tanto as células endoteliais linfáticas iniciais e de coleta, optaram por não usar LYVE-1 como parte de nossa estratégia de seleção de célula. Finalmente, a decisão de utilizar estes marcadores também baseou-se na disponibilidade de anticorpos que são utilizados diagnosticamente para a marcação de vasos linfáticos para imagem microscópica, uma característica que permita correlação entre estudos de citometria de fluxo e imunof luorescência. Este artigo irá descrever o método de digestão de tecidos, coloração de células e configurações FACS necessário para isolamento de células CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 POS podoplanin Pos LECs, bem como as células endoteliais CD34 CD31 alta Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin do prepúcio e malformação linfática tecido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

Do sistema linfático, como linfedema primário, malformações linfáticas e tumores linfáticos são condições raras que causam morbidade significativa, mas pouco se sabe sobre a sua biologia. Isolamento de células altamente puros humanas endoteliais linfáticas (LECs) a partir de tecido doente e saudável iria facilitar estudos sobre o endotélio linfático em níveis genéticos, moleculares e celulares. Prevê-se que estas investigações podem revelar alvos para novas terapias que podem mudar o manejo clínico dessas condições. Um protocolo descrevendo o isolamento de prepúcio humano LECs e células endoteliais linfáticas malformação linfática LM (LECs) é apresentada. Para obter uma única suspensão de células do tecido foi triturada e tratada enzimaticamente usando colagenase e dispase II II. A suspensão de célula única resultante foi, em seguida, marcadas com anticorpos para o aglomerado de diferenciação (CD) marcadores CD34, CD31, Factor de Crescimento Endotelial Vascular-3 (VEGFR-3) e podoplanin. Staicélulas viáveis ​​nidas foram classificados em um separador de células activado por fluorescência (FACS) para separar o CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 população Pos Pos podoplanin LM LEC de outro endoteliais e células não endoteliais. Os LM LECs ordenados foram cultivadas e expandidas em frascos revestidos com fibronectina para uso mais experimental.

Após a digestão do tecido inicial, após 24 horas em cultura de amostras não fraccionadas, as colónias de células endoteliais podem ser observadas (Figura 2A), juntamente com as células semelhantes a fibroblastos e células musculares lisas. Seguindo triagem e após 24 horas em cultura de células, as células CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 células Pos Pos podoplanina anexar e mostram a morfologia típica de calçada (Figura 2B e C). Utilizando...

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Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular.

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K visualizações.  The Royal Children&#146;s Hospital.  O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular. 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Medicina

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.