Este método permite a modelagem precisa de mutações leucomogênicas recorrentes de ganho de função em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras humanas primárias e, assim, investigar o papel na transformação leucêmica. A principal vantagem desta técnica é que a engenharia de mutação baseada em CRISPR-Cas9 é combinada com a introdução de um repórter fluorescente. Isso permite exclusivamente a identificação, o enriquecimento e o rastreamento de populações celulares heterozigicamente mutantes puras.
Demonstrando o procedimento estará Tommaso Sconocchia, pesquisador de pós-doutorado do meu laboratório. Para começar, projete o RNA de guia único usando a ferramenta de design de Bancada on-line selecionando a opção de criação de mais. Em seguida, clique em "sequência de DNA" seguido de importar sequências de DNA" e importar de bancos de dados"opção.
Em seguida, insira o gene desejado e selecione humano"como a espécie. Clique na opção "search" e selecione a importação de transcrição correta. Selecione a região de interesse na qual a quebra de fita dupla será introduzida.
Em seguida, selecione a opção CRISPR no lado direito da tela, seguida de guias de design e análise. Em seguida, selecione guia única", mantendo o comprimento da guia em 20 pares de bases e sequência PAM para edição com SP-Cas9. Escolha um guia com uma alta pontuação no alvo e uma alta pontuação fora do alvo e solicite o RNA guia único como um RNA sintético de guia único quimicamente modificado de um fornecedor comercial.
Para projetar o modelo HDR, importe a sequência genômica e a sequência de codificação para um software para clonagem molecular. A partir do arquivo de sequência genômica, projete o braço de homologia esquerdo selecionando, idealmente, 400 pares de bases nas cinco extremidades primos das quebras de fita dupla e cole essa sequência em um novo arquivo. A partir do arquivo de sequência genômica, projete a sequência do aceitador de emenda selecionando os últimos 150 pares de bases do íntron alvo e colando-o após o braço de homologia esquerdo.
No arquivo de sequência de codificação, selecione o cDNA de interesse. Códon otimizar o cDNA e inseri-lo após a sequência de aceptor de emenda. Após o cDNA de interesse, insira um sinal de poliadenilação de três primos seguindo uma sequência promotora para a proteína fluorescente.
Em seguida, insira a sequência para a proteína fluorescente e um segundo sinal de poliadenilação diferente. A partir do arquivo de sequência genômica, projete o braço de homologia direito selecionando idealmente 400 pares de bases nas três extremidades primos das quebras de fita dupla e insira a sequência após a segunda poliadenilação. Em seguida, crie uma cópia de todo o modelo e modifique o cDNA de interesse para que ele contenha a sequência da mutação desejada.
Troque a proteína fluorescente por uma proteína fluorescente diferente. Construa e clone os modelos HDR no vetor de expressão AAV. Para a preparação recombinante de AAV6, prepare 10 pratos de 150 milímetros, cada um contendo 11 milhões de HECK293T em 20 mililitros de DMEM suplementados com 10% FBS, 1% de estreptomicina de penicilina e 25 HEPES milimolares.
Em seguida, coloque os pratos na incubadora a 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%, por 24 horas. Depois de descartar cuidadosamente o meio antigo, substitua-o por 20 mililitros de DMEM livre de antibióticos, suplementado com 10% de FBS, 25 milimolares de EPES e um butirato de sódio milimolar. Em seguida, prepare dois tubos de 15 mililitros rotulados tubos um e dois.
Ao tubo um, adicione cinco mililitros de meio sérico reduzido, 60 microgramas de plasmídeo HDR recombinante com mutação AAV6 e 220 microgramas de plasmídeo auxiliar PDGM6. Ao tubo dois, adicione cinco mililitros de meio sérico reduzido e 1120 microlitros de um miligrama por mililitro de solução de polietileno amina. Depois de adicionar o conteúdo do tubo dois ao tubo um, vórtice por 30 segundos e, em seguida, incube por 15 minutos à temperatura ambiente.
Adicione cuidadosamente 1,1 mililitros da solução a cada prato e distribua rodopiando suavemente. Coloque os pratos na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por 48 horas. Em seguida, adicione 250 microlitros de EDTA 0,5 molar a cada prato e coloque-os na incubadora por 10 minutos.
Colha as células lavando-as do prato e transfira para um tubo de centrífuga de 500 mililitros. Centrifugar a 2000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante. Solte o pellet por vórtice e extraia o vírus usando um kit de purificação de AAV.
Depois de alíquota do vírus purificado, armazene-o a menos 80 graus Celsius. Após o descongelamento das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras CD34 positivas, transfira as células para 10 mililitros de RPMI pré-aquecido suplementado com estreptomicina de 1% de penicilina. Centrífuga a 350 G à temperatura ambiente durante 10 minutos.
Suspender as células em meio de retenção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras até uma concentração de 250.000 células por mililitro e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Em seguida, colha as células em um tubo de 15 mililitros. Conte e verifique a viabilidade celular por exclusão azul de tripano.
Para preparar o complexo ribocucleoproteico, adicione 15 microgramas de Cas9 e oito microgramas de RNA guia único em um tubo de 1,5 mililitro e incube a 25 graus Celsius por 10 minutos em um bloco de aquecimento. Enquanto o complexo ribonucleoproteico está incubando, centrifugar as células a 350 G por cinco minutos e descartar o sobrenadante. Depois de suspender as células em 100 microlitros de solução de nucleofeção, misture as células com o complexo ribonucleoproteico e transfira-as para a cubeta.
Depois de bater suavemente na cubeta para remover quaisquer bolhas de ar residuais, insira a cubeta no suporte do sistema de transfecção e eletropore as células. Imediatamente após a eletroporação, adicionar 400 microlitros de meio de retenção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras pré-aquecido sem estreptomicina de penicilina e transferir as células com uma pipeta de transferência fina para uma placa de cultura contendo caule hematopoiético pré-aquecido e meio de retenção de células progenitoras sem estreptomicina de penicilina. Em seguida, transfira a placa para a incubadora.
Descongele os frascos para injetáveis contendo os AAVs recombinantes congelados no gelo e transduzir as células pipetando a quantidade ideal de cada AAV6 recombinante para a suspensão celular. Depois de misturar suavemente a suspensão celular com a pipeta, incubar as células transduzidas por seis a oito horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após seis a oito horas, colete as células em um tubo e centrifuga-as a 350 G à temperatura ambiente por cinco minutos.
Descarte o sobrenadante e substitua-o por um meio de retenção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras pré-aquecido fresco suplementado com estreptomicina de penicilina e transfira as células para uma placa de cultura celular. Incubar as células por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para classificar em fluxo as células modificadas que carregam a mutação heterozigótica de ganho de função, colher as células em um tubo de 15 mililitros e centrifugar a 350 G à temperatura ambiente por cinco minutos, como demonstrado anteriormente.
Remova o sobrenadante e suspenda as células em um mililitro de DPBS contendo 0,1% de PSA e centrifugar novamente a 350 G à temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, suspenda as células em um volume apropriado de DPBS mais 0,1% de BSA, dependendo do número de células, conforme demonstrado anteriormente. Transfira as células para um tubo de fax estéril equipado com uma tampa e adicione sete AAD ou outro corante de viabilidade à suspensão celular para exclusão de células vivas/mortas.
Classifique as células vivas que são duplamente positivas para as proteínas repórteres fluorescentes em um tubo de coleta contendo 200 microlitros de caule hematopoiético e meio de retenção de células progenitoras. Depois de centrifugar as células classificadas a 350 G à temperatura ambiente durante cinco minutos, como demonstrado anteriormente, a uma concentração de 250.000 células por mililitro para posterior expansão em cultura ou utilizar as células diretamente para ensaios funcionais. Dois dias após a transvecção com o complexo ribonucleoproteico e a transdução com os vírus AAV6 recombinantes, as células foram analisadas por citometria de fluxo.
Quatro populações principais foram detectadas, incluindo células sem edição de genoma baseada em HDR expressando nem a GFP nem as células BFP positivas apenas para GFP com apenas o construto tipo selvagem integrado, células positivas apenas para BFP com apenas o constructo mutado integrado, e GFP e BFP células duplamente positivas com o tipo selvagem e sequências mutadas integradas. Para validar o knock-in bem-sucedido das mutações da calreticulina heterozigótica in/out PCR foi realizado em DNA genômico extraído de células incubadas apenas com AAV e de células incubadas com a ribonucleoproteína e AAV com o tipo selvagem de calreticulina knocked-in e sequência de deleção de calreticulina. As células foram classificadas com base na expressão simultânea de ambos os repórteres de fluorescência antes da extração do DNA.
Após a eletroforese em gel, bandas individuais foram extirpadas do gel e o DNA foi extraído para posterior sequenciamento de Sanger. Os resultados do sequenciamento confirmaram a integração perfeita bem-sucedida do tipo selvagem e das sequências mutantes nas células-tronco hematopoiéticas e progenitoras heterozigotas mutadas com calreticulina. A coisa mais importante a lembrar ao tentar este procedimento é selecionar cuidadosamente o RNA guia único de melhor desempenho, pois isso determinará a eficiência geral do HDR e, portanto, a frequência de knock-in bem-sucedido de mutações heterozigotas.
Após este procedimento, as células geneticamente modificadas podem ser usadas para experimentos funcionais in vitro e in vivo, como ensaios de unidade formadora de colônias, ensaios de diferenciação e transplante em camundongos imunodeficientes.
