Apresentamos uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica para fenotipagem mecânica de células únicas. Especificamente, medimos propriedades elásticas e viscosas de célula única a uma taxa de transferência de até 10 células por segundo. Nosso método requer uma preparação mínima da amostra, utiliza uma medição eletrônica direta, substituindo hardware óptico caro e análise de imagem complexa, e não é destrutivo, o que significa que nossa abordagem é compatível com análises a jusante.
O Mechano-NPS tem sido aplicado a muitos tipos de células, incluindo amostras primárias, e mediu o efeito de componentes subcelulares na viscoelasticidade de célula única. Ele poderia ser usado para entender o comportamento celular, determinar a progressão da doença ou monitorar a resposta a medicamentos. Para começar, remova os componentes tratados com plasma da câmara de plasma.
Pipetar uma solução de dois para um de metanol e água deionizada sobre o substrato de vidro com eletrodos pré-fabricados. Em seguida, coloque o molde PDMS com o recurso virado para baixo em cima do substrato de vidro. Coloque o dispositivo sob o estereoscópio para ajustar o alinhamento.
Asse o dispositivo alinhado para concluir a fabricação do dispositivo. Prepare a fonte de pressão, a PCB, o hardware de bancada e o software de aquisição de dados. Em seguida, alinhe os pinos do conector do grampo com os orifícios da PCB e alinhe os pinos carregados da mola do grampo com as almofadas de contato do eletrodo no dispositivo microfluídico.
Em seguida, insira os pinos do conector das braçadeiras nos orifícios da PCB, certificando-se de que os pinos carregados com a mola permaneçam alinhados com as almofadas de contato do eletrodo. Configure e conecte o hardware eletrônico. Em seguida, defina os valores para inicializar a sessão de aquisição de dados e defina a taxa de amostragem para aquisição.
Cultivar e preparar as células de acordo com o protocolo de cultura celular apropriado da linhagem celular de escolha. Em seguida, suspenda as células em uma solução preparada de 2%FBS e 1X PBS a uma concentração entre 100.000 e 500.000 células por mililitro. Mantenha as células no gelo durante a duração dos experimentos.
Para carregar as células no dispositivo microfluídico, corte 30 centímetros de tubo de politetrafluoroetileno com uma lâmina de barbear. Use uma seringa para soltar a amostra de célula na extremidade da tubulação e conecte a mesma extremidade à entrada do dispositivo. Finalmente, conecte a extremidade oposta da tubulação ao controlador de pressão microfluídica.
Para executar o experimento, defina a pressão de acionamento constante desejada no software controlador de pressão e permita que a amostra encha o dispositivo. Se formarem bolhas nos canais microfluídicos, use o preenchimento sem saída. Ligue a tomada do dispositivo e aplique uma pressão baixa à entrada para forçar a saída de ar através do PDMS permeável ao gás.
Em seguida, defina a tensão desejada girando o botão de tensão na fonte de alimentação e ative a tensão pressionando o botão ligado. Ligue o pré-amplificador de corrente e defina a sensibilidade o mais baixa possível. Alternativamente, defina o ganho o mais alto possível sem sobrecarregar o pré-amplificador ou exceder a tensão máxima de entrada analógica do DAQ.
Pressione o botão verde Executar no menu da faixa de opções do MATLAB para iniciar o NPS do script de aquisição de dados. m e comece a amostrar e salvar os dados. Para encerrar o experimento, pressione o botão Parar no canto inferior esquerdo da janela de plotagem ao vivo para encerrar o script de aquisição de dados.
Em seguida, desative a saída da fonte de alimentação pressionando o botão Ligado. Finalmente, defina a fonte de pressão para pressão zero no software do controlador de pressão. Para a análise de dados, o sinal bruto deve ter uma relação sinal-ruído suficiente para filtrar o ruído e extrair os componentes significativos.
Criticamente, o aumento do sinal de corrente de cada nó deve ser robusto o suficiente para que os subpulsos possam ser facilmente identificados a partir do sinal de diferença. As células MCF-7 malignas têm uma distribuição wCDI maior do que as células MCF-10A não malignas, indicando que as células MCF-7 malignas são mais macias do que suas contrapartes MCF-10A não malignas. As células MCF-10A e MCF-7 tratadas com latrunculina mostram um aumento no wCDI.
Uma distribuição wCDI distinta diferenciando os dois tipos de células primárias indica que as células LEP são mais macias do que as células MEP. Os MCF-10As não malignos e os MCF-10A e MCF-7 não tratados têm uma proporção maior de células que se recuperam instantaneamente, indicando menor viscosidade do que sua contraparte maligna ou tratada com latrunculina. Se a leitura da corrente ao vivo parecer anormal, pare o experimento e inspecione o canal microfluídico.
Certifique-se de que não haja bolhas de ar e nem entupimentos de modo que as células estejam fluindo livremente da entrada para a saída. Como nosso método não prejudica as células, análises a jusante como RNA-seq ou imunofluorescência podem ser realizadas. Isso poderia ajudar a descobrir algumas razões subjacentes pelas quais as células têm fenótipos mecânicos distintos.
