Este protocolo mostra um guia passo-a-passo para medir a rigidez de hidrogéis e células usando um nanoindenter comercialmente disponível e também apresenta um software de código aberto para analisar de forma reprodutível os dados adquiridos. O protocolo nos permite obter dados semelhantes a microscopia de força atômica, no entanto, em uma fração da complexidade. Portanto, este protocolo será útil para cientistas interessados em estudar propriedades mecânicas de amostras saudáveis e doentes, mas também acreditamos que será de aplicabilidade mais ampla no contexto da nanoindentação para materiais moles.
Depois de ligar o instrumento e montar a sonda selecionada para o experimento, comece a calibrar a sonda. Clique em Inicializar na janela principal do software. No Menu de calibração exibido, insira os detalhes da sonda nas caixas de entrada.
Em seguida, encha uma placa de Petri grossa de vidro com um fundo plano com o mesmo meio que a placa de amostra e combine a temperatura do meio com a da amostra. Em seguida, coloque o prato de calibração sob a sonda. Para calibração em líquido, pré-molhe a sonda com uma gota de etanol a 70% ou isopropanol com a extremidade da pipeta em contacto leve com a arruga de vidro, de modo a que a gota deslize sobre o cantilever e a ponta esférica.
Em seguida, deslize manualmente o braço do nanoindenter para baixo até que a sonda esteja totalmente submersa, mas ainda longe do fundo da placa de Petri. Aguarde cinco minutos para permitir que as condições de equilíbrio sejam alcançadas no líquido. Em seguida, no menu Inicializar do software, clique em Scan Wavelength.
A tela do interferômetro mostrará uma barra de progresso. Verifique se a varredura óptica foi bem-sucedida navegando até o painel Varredura de comprimento de onda na caixa do interferômetro. Em seguida, no menu Inicializar, clique em Localizar superfície para abaixar progressivamente a sonda.
A sonda para de se mover quando entra em contato com a placa de Petri de vidro. Quando a sonda estiver em contato com a superfície, mova a sonda para baixo em um micrômetro usando o botão de seta y para baixo na janela principal do software. Observe o sinal verde na janela ao vivo para mudanças na linha de base a cada passo de um micrômetro.
Em seguida, clique em Calibrar no menu Inicializar. Quando a calibração estiver concluída, verifique os fatores de calibração antigos e novos na janela pop-up exibida. Se o novo fator de calibração estiver na faixa correta, conforme explicado no manuscrito, clique em Usar Novo Fator.
Em seguida, suba o piezo em 500 micrômetros. Em seguida, verifique se o círculo de demodulação foi calibrado corretamente navegando até a guia Demodulação na área de trabalho do interferômetro. Toque suavemente na mesa óptica ou no nanoindenter para induzir ruído suficiente.
Um círculo branco de pontos de dados discretos deve cobrir aproximadamente o círculo vermelho. Carregue a placa de Petri que contém a amostra no estágio do microscópio e mova manualmente a sonda do nanoindenter para uma posição desejada acima da amostra. Deslize a sonda em solução, tomando o cuidado de deixar um a dois milímetros entre a sonda e a superfície da amostra.
Aguarde cinco minutos para que a sonda se equilibre em solução. Concentre-se na sonda com o microscópio óptico. Para medir o módulo de materiais macios de Young, clique em Configurar experimento.
Adicione uma etapa Localizar superfície e um único recuo no controle de deslocamento para determinar parâmetros experimentais a serem usados posteriormente para a varredura automática da matriz. Se o recuo único for bem-sucedido, configure uma varredura de matriz contendo 50 a 100 pontos espaçados em 10 a 100 micrômetros. Depois de garantir que a caixa Localizar Superfície Automaticamente esteja marcada, clique em Usar Posição do Palco para iniciar a varredura da matriz a partir da posição do estágio atual.
Configure o perfil de varredura de matriz no controle de deslocamento. Deixe o número de segmentos para cinco e use o perfil de deslocamento padrão. Se necessário, altere o perfil de deslocamento e o tempo para cada segmento inclinado.
Não exceda as taxas de deformação superiores a 10 micrómetros por segundo. Salve o experimento configurado no caminho do experimento desejado. Clique em Executar experimento e aguarde que ele seja concluído.
Quando todos os dados forem adquiridos, limpe a sonda e desligue o instrumento conforme descrito no texto. Para triagem de curvas de deslocamento de força e produção de conjunto de dados limpos no formato JSON, prepare o lançamento. py a partir da linha de comando no computador do laboratório.
Selecione o formato de dados Optics11 na lista suspensa. Se os dados não forem carregados corretamente, reinicie a interface gráfica do usuário e selecione Optics11 Old. Em seguida, clique em Carregar pasta e selecione uma pasta contendo os dados a serem analisados.
Limpe o conjunto de dados usando as guias presentes à direita da interface gráfica do usuário. Em seguida, clique em Salvar JSON e insira um nome apropriado para o conjunto de dados limpo. Envie o arquivo JSON para o computador onde o software NanoAnalysis foi instalado, se diferente do computador atual.
Inicie o nano. py a partir da linha de comando. No canto superior esquerdo da interface gráfica do usuário, clique em Carregar experimento e selecione o arquivo JSON.
Isso preencherá a lista de arquivos e o gráfico de curvas brutas mostrando o conjunto de dados em termos de curvas de deslocamento de força. Na caixa Estatísticas, marque os valores dos três parâmetros, N ativado, N falhou e N excluído. Para visualizar uma curva específica com mais detalhes, clique na curva.
Isso irá destacá-lo em verde e mostrá-lo no gráfico da curva atual. Uma vez que uma única curva tenha sido selecionada, os parâmetros R e k serão preenchidos na caixa Estatísticas. Depois que o conjunto de dados tiver sido limpo, filtre qualquer ruído nas curvas usando os filtros implementados na caixa Filtragem.
Em seguida, inspecione as curvas filtradas no gráfico de curva atual. A curva filtrada está em preto, enquanto a versão não filtrada é verde. Para encontrar o ponto de contacto, a partir da caixa Ponto de Contacto, escolha um de uma série de procedimentos numéricos que foram implementados no software.
Ajuste os parâmetros do algoritmo para se adequar ao conjunto de dados para que o ponto de contato esteja localizado corretamente, conforme explicado no manuscrito. Para ver onde o ponto de contato foi encontrado em uma única curva, selecione a curva clicando nela. Em seguida, clique em Inspecionar.
Verifique a janela pop-up que aparece para identificar onde o ponto de contato foi localizado. Em seguida, clique em Análise Hertz. Isso gerará três gráficos.
Dados de recuo da força de verificação para cada curva no conjunto de dados, juntamente com o ajuste médio de Hertz mostrado em vermelho. Em seguida, verifique a curva de recuo de força média com uma banda de erro mostrando um desvio padrão, juntamente com o ajuste médio de Hertz mostrado em vermelho. Em seguida, verifique o gráfico de dispersão do módulo de Young originado do ajuste do modelo de Hertz a cada curva individual.
Inspecione a caixa Resultados para a média calculada do módulo de Young e seu desvio padrão, e certifique-se de que eles são razoáveis para o experimento dado. Em seguida, na caixa Salvar, clique em Hertz. Na janela pop-up, digite o nome do arquivo e o diretório e clique em Salvar.
Um arquivo tsv será criado. Abra o arquivo tsv em qualquer software adicional para análise estatística e plotagem adicional. Para obter dados de nanoindentação celular, clique em Análise de espectros de elasticidade.
Inspecione os dois gráficos produzidos, a saber, o módulo de Young em função da profundidade de recuo para cada curva e o módulo médio de Young em função do recuo ajustado por um modelo de bicamada. Quando a análise estiver concluída, clique em ES na caixa Salvar. Isso exportará um arquivo tsv no diretório especificado, que pode ser aberto e plotado em qualquer outro software de escolha.
Um experimento bem-sucedido resulta no segmento de aproximação de uma curva de deslocamento de força, tendo uma linha de base clara e plana, uma região de transição e uma região inclinada. As curvas que mostram alterações desta forma são facilmente removidas do conjunto de dados usando o NanoPrepare. Curvas médias de força-indentação, juntamente com o modelo médio de Hertz para um hidrogel de poliacrilamida macia e um hidrogel rígido, são mostradas aqui.
Plotando valores individuais do módulo de Young, a média esperada do módulo de Young foi recuperada para ambos os hidrogéis. Para experimentos de nanoindentação celular, a curva média de força-indentação e o modelo Hertz médio correspondente demonstram que o modelo de Hertz não captura totalmente a evolução da força com o aumento da profundidade de recuo para experimentos de nanoindentação celular. Os espectros de elasticidade média ajustados até um recuo de 200 nanômetros são demonstrados aqui.
Os espectros de elasticidade média começam a aumentar a uma profundidade de recuo de 200 nanômetros, indicando a contribuição de um substrato para o módulo aparente de Young sondado. Devido a isso, 200 nanômetros foram escolhidos como a faixa de ajuste para o modelo Hertz e bicamada. O ajuste do modelo de bicamada permite extrair mais informações sobre o estado mecânico da célula, incluindo a espessura do córtex de actina celular, o módulo do córtex de actina celular e o módulo de volume celular, conforme explicado no texto principal.
Uma comparação direta entre o modelo de Hertz e a abordagem dos espectros de elasticidade em termos de distribuição do módulo de Young revela distribuições sobrepostas com médias comparáveis, demonstrando a viabilidade da abordagem dos espectros de elasticidade. Localizar com precisão o ponto de contato e manter os parâmetros do algoritmo escolhidos consistentes entre os conjuntos de dados que se deseja comparar é fundamental para obter comparações confiáveis entre as amostras. O método é de aplicabilidade geral para quantificar as propriedades elásticas locais de amostras biológicas, incluindo esferoides, organoides, tecidos e, em geral, toda a matéria mole.
