Este protocolo representa um ensaio funcional in vitro utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos para medir a imunogenicidade vacinal antes de estudos in vivo. Portanto, preenchendo uma lacuna existente na vacinologia animal. É a geração e aplicação de células dendríticas.
Como as células apresentadoras de antígenos mais potentes, as células dendríticas tornaram-se um alvo chave de pesquisa para a compreensão dos mecanismos imunológicos intracelulares, incluindo a eficácia da vacina. Este ensaio pode ser implementado como uma ferramenta para triagem de candidatos vacinais, como um estado de controle de qualidade para a produção de vacinas, e para a seleção de antígenos e adjuvantes. Quem demonstrará o procedimento será Richard Kangethe, cientista do laboratório de produção e saúde animal.
Comece invertendo e misturando o sangue obtido da punção da veia jugular da panturrilha com vacutainers heparinizados. Em seguida, transfira 20 mililitros de sangue heparinizado para um tubo estéril de 50 mililitros e dilua-o com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Pipetar 15 mililitros de meio de isolamento de linfócitos para um tubo estéril de 50 mililitros e inclinar o tubo para uma posição de 45 graus.
Coloque cuidadosamente 30 mililitros de meio PBS de sangue sobre o isolamento de linfócitos usando uma pipeta de 25 mililitros e retorne lentamente o tubo para uma posição vertical antes de centrifuga-lo. Em seguida, colete a fina camada branca de células mononucleares do sangue periférico ou camada PBMC usando uma pipeta de Pasteur e transfira-a para um novo tubo de 50 mililitros. Lave os PBMCs colhidos duas vezes usando 40 mililitros de PBS por lavagem e misture bem.
Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 15 mililitros de tampão potássio cloreto de amônio ou tampão ACK. Após 10 a 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicione até 40 mililitros de PBS e centrifugue o tubo com aceleração e desaceleração máximas. Ressuspender o pellet em 10 mililitros de meio de cultura completo.
Em seguida, adicione cinco microlitros de tampão CD14 MicroBead por 10 milhões de células e misture completamente usando uma pipeta. Para análise por citometria de fluxo, adicionar 10 microlitros de isotiocianato de fluoresceína CD14 ou anticorpo corante FITC aos PBMCs e incubá-lo por 15 minutos a quatro a oito graus Celsius antes de prosseguir com a citometria de fluxo. Para os PBMCs sem manchas, adicione um mililitro de tampão de fax e centrifugue-o por sete minutos a 500g e quatro graus Celsius.
Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de fax por 100 milhões de células. Em seguida, insira a coluna de separação de células imunomagnéticas no separador e coloque um tubo de coleta de 50 mililitros sob a saída da coluna para coletar o fluxo. Depois de lavar a coluna com um tampão de fax desgaseificado de um mililitro, substitua o tubo de 15 mililitros usado por um novo.
Pipetar cem milhões de células em 500 microlitros de tampão de cada vez, permitindo que a suspensão celular passe pela coluna. Em seguida, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de fax desgaseificado de cada vez. Após a coleta do fluxo, rotule a primeira fração de linfócitos virgens eluídos como a fração celular CD14 negativa.
Retire a coluna do separador e coloque um novo tubo estéril de 15 mililitros sob a coluna para a coleta de efluentes. Adicione cinco mililitros de buffer de fax na coluna e empurre-o imediatamente usando o êmbolo. Coletar e rotular o segundo fluxo ou a fração de monócitos virgens como a fração celular CD14 positiva.
Adicione meio de cultura completo aos monócitos CD14 positivos colhidos para atingir 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, adicione uma suspensão de células mililitros a cada poço de uma placa estéril de 24 poços antes de suplementar cada poço com 40 microlitros do coquetel de citocinas fornecido no kit. No segundo dia, transfira metade do conteúdo de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro usando uma pipeta.
Após centrifugar os tubos de 1,5 mililitro a 500g por sete minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 microlitros de meio de cultura fresco completo. Transfira 500 microlitros dessa suspensão de células ressuspensas de volta para os poços correspondentes para que o volume final no poço se torne de um mililitro. Enriqueça cada poço com 20 microlitros de coquetel de citocinas.
Para gerar MoDCs pulsadas por antígeno, adicione um microlitro por mililitro de vacina contra o vírus da raiva ou suspensão de RV a um mililitro de cultura de MoDC ingênua na placa de 24 poços e incube a placa por 48 horas a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. No sétimo dia, mantenha a placa de 24 poços contendo as MoDCs pulsadas por antígeno no gelo por 10 minutos antes de adicionar um mililitro de PBS gelado por poço e misturá-la completamente. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros.
Lave os poços com dois mililitros de PBS gelado. Coletar as células residuais dentro de cada poço e transferir o conteúdo lavado para seus respectivos tubos. Centrifugar a suspensão celular a 500g por sete minutos.
Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda a pastilha de células MoDCs pulsadas por antígeno em meio de cultura completo para ajustar a concentração final de 100.000 células por mililitro. Para a co-cultura de linfócitos MoDC, semeie os poços de uma placa estéril de 24 poços com um mililitro da suspensão de células linfocitárias virgens e um mililitro de suspensão de MoDC pulsada ou não pulsada por antígeno no sétimo dia do pulso de antígeno. Após dois dias de incubação, completar cada poço com 20 nanogramas por mililitro de interleucina-2 recombinante e continuar a incubação por mais 120 horas.
No dia 14, transferir um mililitro da co-cultura para um tubo estéril de 1,5 mililitro e centrifugar o tubo. Em seguida, ressuspenda a pastilha de células com um mililitro de MoDCs pulsadas ou não pulsadas por antígeno. Misture bem e transfira as suspensões celulares para seus poços correspondentes.
Após a coloração da superfície celular das CMSP e dos linfócitos e monócitos virgens, transferir um mililitro da suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro usando pipeta e centrífuga por 10 minutos a 500g. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Colete também as células residuais e os tubos correspondentes usando um mililitro de PBS.
Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS ao tubo de 15 mililitros que contém as células e misture por pipetagem. Após centrifugar o tubo por sete minutos a 850g, retirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet de células com suspensão residual deixada após a decantação do sobrenadante. Transfira a suspensão da célula para uma placa de 96 poços com fundo em V e sele os poços para evitar derramamento.
Uma vez concluída a coloração, realizar a análise do citômetro de fluxo. A partir da visualização em tempo real, ajuste o limiar de fluorescência, incluindo tensão e ganho e tamanho da célula para, eventualmente, desenhar portas em torno da população celular desejada, excluindo quaisquer detritos celulares. A coloração de células CD14 e a citometria de fluxo mostraram que a fração de monócitos virgens de produção era composta por 98% de células de monócitos CD14 positivas e funcionalmente capaz de captar antígenos.
As DCMs virgens fenotipicamente caracterizadas pela avaliação da expressão de MHC Classe 2 e marcadores co-estimulatórios de superfície celular CD86 e CD40 validaram as células dendríticas ou fenótipo DC-like. Durante a co-cultura de linfócitos MoDC no nono dia, uma alteração morfológica mostrando extensão dendrítica foi observada no pulso do VD para MoDCs. Em comparação com a cultura de linfócitos MoDC não pulsada, um aumento significativo na proliferação linfocitária foi demonstrado pela suprarregulação dos marcadores de ativação Ki67 e CD25 nas células T CD4 positivas e CD8 positivas no dia 16 na co-cultura de linfócitos MoDC pulsada.
As células T CD8 positivas das co-culturas MoDC pulsadas maduras exibiram uma upregulation de Ki67 oito vezes maior em comparação com o grupo inespecífico. As células CD4 positivas na mesma co-cultura mostraram um aumento de sete vezes no Ki67 em comparação com os controles, demonstrando a capacidade das MoDCs primed de RV de apresentar o antígeno de RV para linfócitos virgens e ativá-los em uma condição in vitro. A quantificação por qPCR das co-culturas mostrou aumento de mais de 30% na expressão de interferon gama e mais de 5% na expressão de Ki67 em todas as co-culturas usando GAPDH como calibrador.
Uma concentração significativamente maior de interferon gama secretado foi observada na co-cultura de linfócitos MoDC pulsada de VD em comparação com o grupo de tratamento inespecífico. Execute a etapa de camadas muito lenta e cuidadosamente, garantindo que o sangue seja colocado sobre o meio de isolamento de linfócitos. Tenha cuidado extra para coletar todos os PBMCs sem coletar muito material das outras camadas.
Outros métodos como citometria de fluxo, ELISA e PCR quantitativo, entre outros, podem ser aplicados após esse procedimento para avaliar a ativação de marcadores imunes.
