Esta técnica pode identificar eficientemente o genótipo S e identificar com precisão a autoincompatibilidade dos citros, fornecendo informações necessárias para a seleção de árvores polinizadoras adequadas. Esta é uma técnica eficiente em termos de tempo, simples e confiável para selecionar as árvores matrizes apropriadas em programas de melhoramento. Esta técnica é simples e fácil de fazer e fazer experimento pela primeira vez requer paciência e cuidado.
A identificação do genótipo S e o desenho do primer específico S necessitam de maior atenção e cuidado. Quem demonstrará o procedimento será Yu Hu, mestrando do meu laboratório. Comece a coleta de pólen levando as flores de Majia pomelo, Citrus maxima, para o laboratório.
Recolher as anteras com uma pinça e colocá-las numa placa de Petri contendo papel de filtro. Secar os grãos de pólen colocando a placa de Petri contendo as anteras em forno de 28 graus Celsius por 24 horas. Após a secagem, guarde o pólen em um saco zip lock hermético Micro Centron contendo sílica gel que muda de cor.
Feche o saco e rotule-o com o nome da variedade de pólen e a data de armazenamento. Despeje 300 microlitros do meio líquido na tampa de um tubo de centrífuga de dois mililitros e polvilhe o pólen uniformemente com a ajuda de uma escova de polinização. Coloque o pólen em uma caixa preta umidificada e incube a 28 graus Celsius por 12 horas.
Após a incubação, corte a ponta superior de um milímetro de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros e aspirar o pólen com uma pequena quantidade de solução de cultura. Coloque o pólen no centro da lâmina do microscópio e cubra-o com uma lamínula. Uma vez feito, observar o espécime com um microscópio invertido usando uma objetiva de 10X.
Execute três réplicas independentes usando aproximadamente a mesma densidade de pólen para cada réplica. Para a polinização, use uma escova de polinização para espalhar uma quantidade suficiente de pólen viável na superfície do estigma, garantindo que não danifique o pistilo. Cubra as flores polinizadas com um saco de papel sulfato e evite a polinização por pólenes genotipicamente distintos, selando o saco com um clipe de papel.
Escreva o nome da espécie e o número e o tempo de polinização no rótulo. Pendure o rótulo nos galhos próximos às flores polinizadas. Retirar os sacos de polinização aproximadamente três a quatro dias após a polinização e coletar as flores polinizadas em sacos zip lock.
Remova imediatamente as pétalas, recipientes e ovários das flores e mergulhe o estigma fundido em um tubo de centrífuga contendo uma solução fixadora recém-preparada. Incube o estigma e o estilo na solução fixadora durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, descarte a solução fixadora antes de lavar o estigma e modelar de duas a três vezes em etanol 95%.
Em seguida, adicione a solução de etanol a 70% ao estilo, garantindo que a amostra esteja completamente imersa na solução. Os estilos nesta fase podem ser armazenados a quatro graus Celsius por um a dois meses. Para coloração de azul de anilina, lavar as amostras de estilo armazenadas em etanol 70% com água destilada de três a quatro vezes.
Mergulhe-o em uma solução de hidróxido de sódio de quatro molares e sele antes de incubá-lo em banho-maria de 65 graus Celsius por 60 minutos. Durante esta etapa, a cor do estilo muda de amarelo-branco para laranja-vermelho. Em seguida, mergulhe os estilos em água destilada.
Após 30 minutos, descarte a água destilada e lave os estilos com água destilada de três a quatro vezes ou até que a cor do estilo fique amarela. Em seguida, adicione o azul de anilina até que a amostra esteja submersa e incube por 12 horas no escuro. Observar o crescimento do tubo polínico ao microscópio de fluorescência.
Coloque o slide em uma mesa plana. Divida o estilo em duas metades ao longo do eixo longitudinal usando um bisturi. Coloque metade do estilo em uma lâmina de vidro e adicione duas a três gotas de polietilenoglicol à superfície da lâmina.
Em seguida, cubra com uma tampa. Uma vez feito, coloque a lâmina no estágio do microscópio acima da abertura e visualize usando uma objetiva de 10X. Use o filtro DAPI e observe o crescimento do tubo polínico.
Observe cinco estilos para cada tipo de polinização. A viabilidade polínica de Citrus maxima e as taxas de germinação foram quantificadas por microscopia fluorescente. O pólen compatível germinou com sucesso na superfície do estigma e produziu um tubo polínico normal, que cresceu e, finalmente, levou à fecundação no ovário.
Em contraste, tubos polínicos incompatíveis cresceram através de aproximadamente 2/3 do estilo e depois pararam de crescer. A eletroforese em gel de agarose detectou o produto DNA amplificado usando os primers locus-specific S. Mostrou a amplificação do produto do DNA entre 500 a 1.000 pares de bases.
O genótipo S correspondente foi identificado. 21 haplótipos S em diferentes espécies de citros foram identificados por esse método. A etapa de polinização é fundamental.
Somente a polinização bem sucedida pode garantir a observação subsequente dos tubos polínicos. A técnica foi utilizada para analisar os traços de autoincompatibilidade e explorar e identificar os determinantes femininos da autoincompatibilidade. Este método é importante para pesquisas de autoincompatibilidade e programas de melhoramento.
Também pode facilitar a comunidade agrícola para a seleção de árvores polinizadoras para seus pomares.
