Até onde sabemos, este protocolo é o primeiro a produzir matrizes decelularizadas a partir do músculo esquelético fetal, fornecendo uma nova abordagem para o estudo de miopatias que começam a se desenvolver no útero. Este protocolo gera uma métrica de desenvolvimento e tecido-específica que pode ser usada para estudar o comportamento das células musculares e interações com a matriz extracelular em um ambiente controlado. A DMC-LAMA2 é uma distrofia muscular congênita que começa a se manifestar ao nascimento.
Esse modelo pode ajudar a desvendar os mecanismos padrão envolvidos em seu início e levar a novas terapias-alvo. Este protocolo pode ser adaptado a diferentes tecidos e modelos de doenças. Diferentes níveis de complexidade podem ser alcançados dependendo da matriz e dos tipos celulares, demonstrando a versatilidade do sistema.
Este é um protocolo muito simples. A parte mais desafiadora é a coleta e o manuseio das amostras. Mas, com a prática, as habilidades técnicas podem ser facilmente melhoradas.
Comece transferindo um feto eutanasiado de cada vez para uma placa de Petri contendo PBS gelado. Depois de excisar a pele e os membros, corte o lado ventral da caixa torácica. Remova o esterno e os órgãos subjacentes.
Posicione os fetos dorsais para cima e remova a porção cervical da coluna vertebral. Em seguida, excise os depósitos de gordura dorsal e o tecido conjuntivo muscular profundo das costas. Agora, ancore a caixa torácica usando pinças cirúrgicas.
Com um microbisturi, raspe cuidadosamente para separar os músculos profundos das costas do tecido circundante. Armazenar os tecidos em PBS em uma placa de cultura celular de 12 poços a quatro graus Celsius para uso futuro. Por um período mais longo, armazene o tecido em um tubo de microcentrífuga vazio a 80 graus Celsius negativos.
No primeiro dia, utilizar massas musculares epaxiais inteiras. Adicionar três mililitros de tampão hipotônico contendo 1% de penicilina e estreptomicina a cada poço de uma placa de 12 poços. Adicione um fragmento de tecido muscular a cada poço e incube durante a noite por 18 horas com agitação.
No segundo dia, remova o tampão com uma pipeta de ponta fina. Agora lave as amostras três vezes com três mililitros de PBS com uma agitação de uma hora de cada vez. Após o descarte do PBS, incubar as amostras em três mililitros de solução detergente SDS a 0,05% por 24 horas com agitação.
No terceiro dia, utilizar uma pipeta fina para retirar o detergente SDS e lavar os fragmentos três vezes com três mililitros de tampão de lavagem hipotônico com agitação de 20 minutos cada vez. Substitua a solução dos poços por dois mililitros de solução de DNase e incube os fragmentos de tecido a 37 graus Celsius por três horas com agitação. Após a remoção da solução de DNase, lave os fragmentos três vezes com três mililitros de PBS com uma agitação de 20 minutos de cada vez, deixando a última lavagem durante a noite.
A um frasco T-25 semeado com células C2C12 subconfluentes, adicionar 500 microlitros de tripsina e ressuspender em um mililitro de meio completo. Misturar 10 microlitros da suspensão com 10 microlitros de corante azul de tripano e carregar em um hemocitômetro para contar o número de células e estimar a viabilidade. Em uma capela de fluxo laminar, colocar as matrizes decelularizadas, ou dECMs, em uma placa de Petri contendo PBS com penicilina a 1% e estreptomicina.
Usando um microbisturi e uma pinça, separe as matrizes em pequenos pedaços. Transfira os fragmentos para os poços de uma placa de 96 poços, colocando de três a quatro pedaços por poço. Adicione 200 microlitros de meio de cultura completo pré-aquecido em cada poço e incube a placa por duas horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Descarte o meio na placa do poço e adicione 200 microlitros de meio de cultura completo contendo 50.000 células C2C12 viáveis a cada poço. Incubar a placa do poço por dois dias. Transfira as dECMs com as células para uma placa de 48 poços contendo 400 microlitros de meio de cultura completo.
Aspirar cuidadosamente o meio a cada dois dias para evitar o descolamento da matriz e reabastecer com o meio fresco até o oitavo dia. Para diferenciação, substituir o meio de cultura completo por um meio de diferenciação e incubar por quatro dias até o 12º dia. O tecido muscular ficou avermelhado imediatamente após o isolamento e ficou esbranquiçado devido à lise celular após incubação em tampão hipotônico.
SDS faz com que os músculos se tornem transparentes. Após o tratamento com DNase, obteve-se uma dECM menor e transparente. A quantificação do DNA revela uma diminuição de quase 100% nas dECMs em comparação com o tecido nativo.
As dECMs e o tecido nativo apresentaram coloração tubular semelhante para laminina alfa dois e proteína laminina. A análise por Western blot do tecido nativo mostrou duas bandas para a subunidade dois da laminina alfa, enquanto três bandas menores foram detectadas na dMEC. Para as lamininas totais, as amostras de dECM apresentaram fragmentação proteica quando comparadas ao tecido nativo.
A fibronectina e o colágeno I estavam presentes no espaço intersticial entre as células do tecido nativo e as dECMs. Bandas de fibronectina semelhantes estavam presentes em ambas as amostras, indicando que ela não é afetada pela decelularização. Menos bandas de colágeno I foram observadas nas dECMs.
Para colágeno IV, ambas as amostras apresentaram coloração tubular semelhante. Entretanto, o peso molecular das bandas dECM foi menor. As células C2C12 colonizaram e proliferaram nas dECMs e se fundiram em miotubos multinucleados.
Estes expressaram miosina-proteína de cadeia pesada após quatro dias de incubação em meio de diferenciação. Colorações intracelulares e pericelulares foram observadas para laminina alfa de duas cadeias, lamininas totais e fibronectina. Scaffolds esqueléticos fetais de camundongos descelularizados podem ser usados para cultivar células em sistemas de co-cultura, aproximando-as da situação in vivo e, portanto, contribuindo para o entendimento da doença muscular.
