This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

NOTA: Um rato produz mioblastos suficientes para cerca de dois pratos de 35 mm ou dois pratos de geração de imagens ao vivo, então mattings plano, dissecção, e revestimento (passo 2.6) em conformidade. Desde mioblastos são isolados a partir de centrifugações sequenciais e preplating, o protocolo deve ser feito em lotes de 5 - 10 animais. Todos os procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Medicina Molecular e da Universidade Pierre et Marie Curie 1. Dissecção do Ratos Neonatal Músculos Hind-membros <ol><li> Preparar todas as soluções previamente (Tabela Materiais) e esterilizar por filtração (filtro de 0,22 nm). Certifique-se de todos os meios de comunicação estão a 37 ° C antes da adição às células, com excepção das formulações contendo matriz de membrana basal (por exemplo, Matrigel). </li><li> Esterilizar o material de dissecção (um de cada: tesoura curva, tesoura reta, pinças regulares,e uma pinça de ponta fina) e bancada de trabalho, limpando-os com etanol 70%. </li><li> Preparar um prato de 100 milímetros de Petri com 5 mL de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS) para a recolha de músculo e mantê-lo em gelo até que o passo de trituração. </li><li> Decapitar P6 - ratos P8 com tesoura reta e esterilizar a pele com etanol 70%. </li><li> Faça uma incisão na pele para trás e puxe-o suavemente para os membros posteriores até que seja removido, expondo completamente a musculatura posterior-membro. </li><li> Utilizar as pinças para remover o tecido de gordura, sem danificar os músculos. </li><li> Para remover os músculos posteriores-membros dorsais, manter o membro alongado e dobrar a pata para expor os tendões do salto. Use as tesouras curvadas para músculo separado do osso, a partir dos tendões, deslizando suavemente e de corte para cima. Extirpar os músculos e colocá-los em DPBS gelado. </li><li> Isolar os quadríceps, apertando o músculo com uma pinça de ponta fina e corte em torno dele sem danificar o fêmur ou a articulação do joelho.</li><li> Após dissecação todos os animais, a uma capa de cultura de célula de fluxo laminar estéril, em que todos os passos que se seguem devem ser realizados. </li></ol> Isolamento 2. mioblasto <ol><li> Remover o excesso de DPBS. Picar o tecido com tesoura curva esterilizadas de modo a obter uma massa uniforme. </li><li> Recolhe-se o tecido moído num tubo de centrífuga cónico de 50 ml com 5 ml de mistura de digestão e incubar-a com agitação a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Parar a digestão através da adição de 6 ml de meio de dissecção e centrifugar a suspensão durante 5 minutos a 75 xg para sedimentar as restante tecido. </li><li> Recolher cuidadosamente o sobrenadante. Certifique-se de não recolher os restos de tecido. Centrifugar-lo a 350 xg durante 5 min; ressuspender-o em 5 mL de meio de dissecção. </li><li> Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m. Adicionar 25 mL de meio de dissecção e preplate-lo em um prato de 150 mm para os 4 h numa incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2 &lt;/ Sub&gt;) para permitir que os fibroblastos para aderir. </li><li> Enquanto preplating, pratos de revestimento com 500 mL de matriz de membrana basal diluído 1: 100 em IMDM a frio durante 1 h, à RT. Lavar uma vez com DPBS e placa as células imediatamente (passo 2.8) ou deixar com meio de crescimento até o chapeamento. </li><li> Após preplating, recolher o sobrenadante e centrifuga-se que a 350 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender-lo no meio de crescimento e contar as células em um hemocitómetro. Ajustar o volume para que entre 150.000 e 250.000 células são banhados por membrana basal prato revestido de matriz. Manter as células numa incubadora de cultura de células. </li></ol> 3. Diferenciação de miofibras NOTA: Depois de 3 d, as células devem começar a fundir e formar miotubos em cerca de 70% de confluência (Figura 1B). <ol><li> Neste ponto, transfectar as células, se desejado, com um siRNA ou de ADN de interesse. Se as células não estão a ser transfectada, mudar directamente para meio de diferenciação e de esquip para o passo 3.4. </li><li> Transfectar com reagentes de transfecção seguindo as instruções do fabricante. Incubam-se as células durante 5 h com complexos de siRNA-lípido (20 nM + 1 ul de reagente) ou complexos ADN-lípido (1 ug + 1 uL de reagente). Otimizar as concentrações de siRNA e de DNA, se necessário. </li><li> Lavá-los uma vez com meio de diferenciação e, em seguida, mudar para o novo meio de diferenciação. </li><li> No dia seguinte, dilui-se a matriz de membrana basal 1: 2 em meio de diferenciação gelada. Remover o meio e adicionar 200 existente ul de matriz arrefecido com gelo para cada prato. </li><li> Incubar durante 30 min numa incubadora de cultura de células. </li><li> Suplementar o meio de diferenciação com agrina (100 ng / mL) e adicionar cuidadosamente 2 mL para as células. </li><li> Cuidadosamente mudar metade do meio a cada 2 d, sempre que completa com agrina a uma concentração final de 100 ng / mL. </li><li> Monitorar diferenciação celular e viabilidade. Dependendo de uma variedade de factores tais como (FBS e Chicken extracto de embrião origens), as células podem ter entre 5-10 diferenciação d para atingir plena maturação (Figura 2). </li></ol> 4. A imunocoloração em pratos de vidro de fundo <ol><li> Para a imunocoloração, em qualquer ponto de tempo de interesse, lavagem das células uma vez com DPBS e corrigi-los com PFA a 4%, à TA, durante 10 min. </li><li> Lave-os duas vezes com DPBS. Neste ponto, as células podem ser armazenadas a 4 ° C. </li><li> Permeabilizar-os com 0,5% de Triton X-100 durante 5 min à TA. </li><li> Lavar duas vezes com PBS e bloquear com solução de bloqueio durante 30 minutos à TA. </li><li> Incubar os com anticorpo primário diluído em solução bloqueadora O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com DPBS durante 5 min à TA. </li><li> Incubar-los com o anticorpo secundário e 0,2 ug / ml de DAPI, durante 1 h, à RT. </li><li> Lavar 3x com DPBS durante 5 min à TA. </li><li> Adicionar 200 mL de meio de montagem e proceder à imagem. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

A utilização deste protocolo para a cultura de mioblastos primários dá origem a um nicho especial que alimenta grandemente o desenvolvimento de miofibras. Isto é parcialmente devido a outros tipos de células que estão também presentes em números muito pequenos. Um equilíbrio entre a concentração de mioblastos e pureza da cultura deve ser alcançado. Uma cultura de células boa também depende da qualidade dos produtos utilizados para a formulação de meio. Todos os produtos derivados de origem animal deve ser cuidadosamente testado. Em nossa experiência, as condições de digestão também devem ser monitorados. Como é habitual para culturas primárias, variabilidade experimental pode ser maior do que em estudos com fibras isoladas imortalizadas ou mioblastos. Esta variabilidade pode ser diminuída pela normalização dos componentes do meio e da digestão, ratos idade e o tamanho, e os pontos de tempo para a manipulação de cultura e recolha de resultados. No entanto, a vantagem de analise em tempo real, os mecanismos complicadosnecessárias para o desenvolvimento de células musculares ultrapassa grandemente a desvantagem da variabilidade. Este protocolo confere as vantagens de abordagens in vitro sem comprometer a diferenciação celular. Miofibras maduras até tríades são formados e as contracções são acoplados a faíscas de cálcio. Estas saídas funcionais podem ser acessados ​​em diferentes condições experimentais. Além disso, pode haver muitas variações técnicas introduzidas no protocolo. Os mioblastos podem ser colhidas a partir de ratos neonatais com mutações de interesse relativamente ao desenvolvimento muscular. As células podem ser lisadas para análise bioquímica em diferentes pontos no tempo de diferenciação. indicadores de cálcio pode ser adicionado à cultura de seguir a sua dinâmica. construções optogenética pode ser usada para impor certas vias de sinalização ou para induzir respostas locais específicos. Finalmente, as miofibras podem ser co-cultivadas com outros tipos de células para estudar as suas interacções.

O músculo esquelético compõe-se de 40% do peso do corpo humano 1. Distúrbios associados com musculares representam uma imensa de saúde e dos custos económicos 2. Como este tecido altamente complexo e organizado é formado, mantidos e regenerado constitui um campo de pesquisa extensa e bem estabelecida. Dependendo do interesse científico específico, a abordagem mais adequada pode variar entre culturas miotubos simples aos mais complexos modelos in vivo 3 - 6. O objetivo deste protocolo é o de proporcionar um sistema in vitro que permite a monitorização de miogênese através de imagens ao vivo e imunofluorescência. Em comparação com as abordagens tradicionais, este sistema oferece uma visão muito completa e dinâmica no processo miogênica mouse. As células podem ser seguidas a partir da fase de mioblastos ao myofiber madura, multinucleadas exibindo tríades transversais e núcleos periféricos 7. Este nível de maturação podeser obtida utilizando equipamento de cultura celular normal, sem a necessidade de aparelhos estimuladores ou mecânicos complexos. Embora algumas bem sucedidas em sistemas in vitro têm sido relatados 8,9, a nosso conhecimento, este é o único protocolo de gerar fibras musculares maduras rato com a T-túbulos transversalmente emparelhado com Sarcoplasmic Reticulum (SR). Assim, este sistema in vitro pode ser utilizada para estudar os mecanismos moleculares da formação tríade, que são ainda pouco compreendidos 10. Uma outra vantagem da utilização deste sistema é a disponibilidade de recursos destinados-rato validadas, tais como anticorpos, drogas e instrumentos de ARNi. O protocolo relativamente simples não requer etapas trabalhosas, manipulação altamente qualificados, ou equipamentos caros e dedicado. Myofibers amadureceu começam a aparecer após 5 d de diferenciação de cultura 7, exibindo contratilidade juntamente com faíscas de cálcio (dados não publicados). Em uma semana, o desenvolvimento diferenteal fases de uma das células mais complexas no corpo de um mamífero pode ser estudada em combinação com uma variedade de ensaios in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase&#160;type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM, Glutamax supplemented</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth reduced factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be &#60;1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP biomedical</td>
			<td>2850145</td>
			<td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant rat agrin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>550-AG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>11581831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>used to transfect siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>used to transfect DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668030</td>
			<td>used to transfect siRNA plus DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>Science Services GmbH</td>
			<td>E15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 200ng/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			5 mg/ml collagenase 
			3.5 mg/ml dispase 
			sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			10% FBS 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			20% FBS 
			1% Chicken Embryo Extract 
			1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			2% Horse Serum 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			10% Goat Serum 
			5% BSA 
			add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

Os músculos esqueléticos são compostos de miofibras, as maiores células no corpo de um mamífero e um dos poucos sincicios. Como as estruturas complexas e evolutivamente conservadas que o compõem são montados permanece sob investigação. Suas características de tamanho e fisiológicas, muitas vezes restringir aplicativos de manipulação e de imagem. A cultura das linhas celulares imortalizadas é amplamente usada, mas ela só pode replicar os primeiros passos de diferenciação. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a manipulação genética fácil de miofibras provenientes de mioblastos principal do mouse. Após uma semana de diferenciação, as miofibras exibir contractilidade, alinhados sarcómeros e tríades, bem como núcleos periféricos. Todo o processo de diferenciação pode ser seguido por meio de imagens ao vivo ou imunofluorescência. Este sistema combina as vantagens de a existente ex vivo e em protocolos in vitro. A possibilidade de fácil e eficiente, assim como a transfecçãoa facilidade de acesso a todos os estágios de diferenciação amplia as aplicações potenciais. Miofibras podem subsequentemente ser utilizados não só para responder a questões de desenvolvimento e biologia celular relevantes, mas também para reproduzir fenótipos da doença muscular para aplicações clínicas.

A extensão do desenvolvimento da fibra muscular é em grande parte determinado pela pureza e viabilidade dos mioblastos isolados. A adesão, proliferação, e a capacidade de fusão pode ser utilizado para aceder empiricamente os parâmetros (Figura 1 A, B). No proliferação D2, mioblastos deveria ter respeitado e deve apresentar a forma típica fusiforme. Proliferação se espera que aconteça extensivamente nesta fase, que conduz à formação de miotubos espontânea no dia seguinte (Figura 1B). confluência celular pode precisar de pequenos ajustes. Deve ser aumentada se mioblastos tomar mais do que 3 d para proliferar e se fundem. Deve ser diminuída se miofibras não são deixadas a crescer e alongada relativamente simples devido à sua densidade. Confluência tipicamente diminui a partir do centro para a periferia do prato, de modo a melhor miofibras devem ser encontrados para as regiões exteriores. Miotubos rapidamente alongado e vários monitores núcleos alinhadas centralmente (Figura 1C). Por D5, algumas células começam a adquirir estrias e movendo-se os seus núcleos para a periferia. O número de miofibras maduras com características irá aumentar com o tempo, bem como com a espessura das células (Figura 1D). O grau de diferenciação pode ser mais observada por imunofluorescência. Miofibras fixos na diferenciação D8 tríades presentes transversais. Isto pode ser confirmado por componentes de imagem dos túbulos T (DPHR) e o SR (triadin), que se prevê venham a colocalize em tríades (Figura 2). A funcionalidade de miofibras podem ser tratadas por meio de imagens ao vivo. De diferenciação D3 em diante, as células apresentam espasmos espontâneos. Por transfecção de um sensor de cálcio (por exemplo,., GCaMP6f 11), é possível observar que as contracções são acoplados com picos de cálcio (Figura 3). Usando este sistema, fomos capazes de identificar um caminho molecular romance que é interrompido nas miopatias centronuclear e distrofias miotônica, que pode, portanto, ser um novo alvo para terapias moleculares inovadoras 7. Também se adaptaram este método para estudar o desenvolvimento da junção neuromuscular (JNM) 12. Através da co-cultura com ratos explantes da medula espinhal, descrevemos um papel para dineína no MNJ formação 13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Figura 1: estágios de desenvolvimento da cultura mioblasto. A) A proliferação D2, mioblastos aderiram e começaram a proliferar. B) No prolifração D3, uma confluência de 60-80% é alcançado, e mioblastos começar a fundir espontaneamente. C) Em D3 diferenciação, miotubos contendo núcleos localizados centralmente são predominantes. D) A partir de diferenciação D5 em diante (por exemplo, dia 8), myofibers começar exibindo estrias e núcleos periféricos e começar a engrossar. Barra de escala: 50 ^ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Figura 2: Representante confocal Imagem de um D8 miofibras imunocoloração. A) A imunocoloração para o receptor dihidropiridina (DHPR, painel superior) e triadin (TRDN, painel do meio). Uma sobreposição dos canais DHPR, TRDN e DAPI mostra co-localização dos componentes da tríade. B)<html> Um perfil de intensidade da linha amarela desenhado em A. C) Uma imagem 3D de renderização de volume de miofibras coradas para α-actinina (verde) e DAPI (azul). Escala de barra e grade width: 5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Figura 3: Imagens ao vivo dos níveis de cálcio em miofibras com Spontaneous Twitching. A) de alta velocidade de lapso de tempo (20 ms quadros) microscopia de uma faísca de cálcio em um myofiber espasmos. Cálcio foi detectado através da expressão de GCaMP6f (Addgene plasmídeo # 40755). B) Quantificação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo para o sensor de cálcio no painel A._blank &quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Na diferenciação in vitro de miofibras maduras for Imaging ao vivo

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K visualizações.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Vídeo: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Na diferenciação in vitro de miofibras maduras for Imaging ao vivo

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