למיטב ידיעתנו, פרוטוקול זה הוא הראשון לייצר מטריצות דה-צלולריות משרירי השלד העוברי, ומספק גישה חדשנית לחקר מיופתיות שמתחילות להתפתח ברחם. פרוטוקול זה מייצר מדדים התפתחותיים וספציפיים לרקמות שניתן להשתמש בהם כדי לחקור התנהגות תאי שריר ואינטראקציות עם מטריצה חוץ-תאית בסביבה מבוקרת. LAMA2-CMD היא ניוון שרירים מולד שמתחיל להתבטא בלידה.
מודל זה יכול לעזור לפענח את מנגנוני הדפוסים המעורבים בתחילתו ולהוביל לטיפולי מטרה חדשים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לרקמות שונות ומודלים שונים של מחלות. ניתן להשיג רמות מורכבות שונות בהתאם למטריצה ולסוגי תאים, מה שמדגים את הרבגוניות של המערכת.
זהו פרוטוקול פשוט מאוד. החלק המאתגר ביותר הוא איסוף הדגימות והטיפול בהן. אבל, עם תרגול, מיומנויות טכניות ניתן לשפר בקלות.
התחילו בהעברת עובר אחד בכל פעם לצלחת פטרי המכילה PBS קר כקרח. לאחר כריתת העור והגפיים, לחתוך דרך הצד הגחוני של כלוב הצלעות. הסר את עצם החזה ואת האיברים הבסיסיים.
מקמו את הצד הגבי של העובר כלפי מעלה והוציאו את החלק הצווארי של עמוד השדרה. לאחר מכן, הבלו את משקעי השומן הגבי ואת רקמת החיבור של שריר הגב העמוק. כעת, עגנו את כלוב הצלעות באמצעות מלקחיים כירורגיים.
בעזרת מיקרואזמל, מגרדים בזהירות כדי לנתק את שרירי הגב העמוקים מהרקמה שמסביב. אחסנו את הרקמות ב-PBS בצלחת תרבית תאים בת 12 בארות בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לתקופה ארוכה יותר, אחסנו את הרקמה בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.
ביום הראשון, להשתמש מסות שריר epaxial שלם. הוסיפו שלושה מיליליטר של חיץ היפוטוני המכיל 1%פניצילין וסטרפטומיצין לכל באר של צלחת בת 12 בארות. מוסיפים שבר רקמת שריר לכל באר ודגרים במשך לילה במשך 18 שעות עם תסיסה.
ביום השני, הסר את החיץ עם פיפטה עדינה. עכשיו לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של PBS עם תסיסה של שעה בכל פעם. לאחר השלכת PBS, לדגור את הדגימות בשלושה מיליליטר של 0.05% SDS דטרגנט פתרון במשך 24 שעות עם תסיסה.
ביום השלישי, השתמשו בפיפטה-פיפטה עדינה כדי להסיר את חומר הניקוי SDS ולשטוף את השברים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של חיץ כביסה היפוטוני עם תסיסה של 20 דקות בכל פעם. להחליף את הפתרון של הבארות עם שני מיליליטר של פתרון DNase לדגור את שברי הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות עם תסיסה. לאחר הסרת תמיסת DNase, שטפו את השברים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של PBS עם תסיסה של 20 דקות בכל פעם, והשאירו את השטיפה האחרונה למשך הלילה.
לבקבוק T-25 שנזרע עם תאי C2C12 תת-מתמזגים, הוסף 500 מיקרוליטר טריפסין והשהה מחדש במיליליטר אחד של מדיום שלם. מערבבים 10 מיקרוליטר של התרחיף עם 10 מיקרוליטר של צבע כחול טריפאן וטוענים לתוך המוציטומטר כדי לספור את מספר התא ולהעריך את הכדאיות. במכסה מנוע של זרימה למינרית, הניחו את המטריצות הדה-צלולריות, או dECMs, בצלחת פטרי המכילה PBS עם 1%פניצילין וסטרפטומיצין.
בעזרת מיקרואזלפל ופינצטה, מפרידים את המטריצות לחתיכות קטנות. מעבירים את השברים לבארות של צלחת 96 בארות, ומניחים שלוש עד ארבע חתיכות לכל באר. מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם שחומם מראש לכל באר ודגרים על הצלחת במשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
השליכו את המדיום לצלחת הבאר והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם המכיל 50, 000 תאי C2C12 ברי קיימא לכל באר. דוגרים על צלחת הבאר במשך יומיים. מעבירים את ה-dECMs עם התאים לצלחת באר 48 המכילה 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם.
שאפו את המדיום בזהירות כל יומיים כדי למנוע ניתוק מטריצה וחדשו עם המדיום הטרי עד היום השמיני. לצורך בידול, החליפו את מדיום התרבית המלא במדיום בידול ודגרו במשך ארבעה ימים עד היום ה-12. רקמת השריר הייתה אדמדמה מיד לאחר הבידוד והפכה לבנה עקב ליזה של תאים לאחר דגירה בחיץ היפוטוני.
SDS גורם לשרירים להפוך שקופים. לאחר טיפול DNase, התקבל dECM קטן ושקוף יותר. כימות DNA מגלה ירידה של כמעט 100% ב- dECM בהשוואה לרקמה הטבעית.
ה-dECMs והרקמה הטבעית הציגו צביעה צינורית דומה עבור למינין אלפא שתיים וחלבון למינין. ניתוח כתמים מערביים של הרקמה המקורית הראה שני פסים עבור תת-היחידה אלפא אלפא למינין, בעוד שלושה פסים קטנים יותר התגלו ב-dECM. עבור סך כל הלמינינים, דגימות dECM הראו פיצול חלבונים בהשוואה לרקמה הטבעית.
פיברונקטין וקולגן I היו נוכחים בחלל הבין-תאי שבין תאי הרקמה הטבעית לבין תאי ה-dECM. רצועות פיברונקטין דומות היו קיימות בשתי הדגימות, מה שמצביע על כך שהוא אינו מושפע מדצלולריזציה. פחות רצועות קולגן I נצפו ב-dECMs.
עבור קולגן IV, שתי הדגימות הראו צביעה צינורית דומה. עם זאת, המשקל המולקולרי של רצועות dECM היה נמוך יותר. תאי C2C12 התיישבו והתרבו ב-dECMs והתמזגו לצינורות מיו-צינור רב-גרעיניים.
אלה ביטאו חלבון שרשרת כבד מיוזין לאחר ארבעה ימים של דגירה בתווך התמיינות. צביעה תוך-תאית ופריתאית נצפתה עבור למינין אלפא שתי שרשרת, סך כל הלמינינים ופיברונקטין (fibronectin). פיגומים של שלד עכבר עוברי דה-צלולרי יכולים לשמש לגידול תאים במערכות תרבית משותפת, מה שמקרב אותם למצב in vivo, ולכן תורם להבנת מחלות שרירים.
