우리가 아는 한, 이 프로토콜은 태아 골격근에서 탈세포화된 매트릭스를 생성하는 최초의 프로토콜로, 자궁에서 발생하기 시작하는 근병증을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 통제된 환경에서 근육 세포 행동 및 세포외 기질과의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 발달 및 조직별 메트릭을 생성합니다. LAMA2-CMD는 출생 시 나타나기 시작하는 선천성 근육 이영양증입니다.
이 모델은 발병과 관련된 패턴 메커니즘을 밝히고 새로운 표적 요법으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 조직 및 질병 모델에 적용할 수 있습니다. 매트릭스 및 세포 유형에 따라 다양한 복잡성 수준을 달성할 수 있으며, 이는 시스템의 다양성을 보여줍니다.
이것은 매우 간단한 프로토콜입니다. 가장 어려운 부분은 샘플의 수집 및 처리입니다. 그러나 연습을 통해 기술을 쉽게 향상시킬 수 있습니다.
안락사된 태아를 한 번에 한 마리씩 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮기는 것으로 시작합니다. 피부와 팔다리를 절제 한 후 흉곽의 복부 쪽을 자릅니다. 흉골과 밑에있는 장기를 제거하십시오.
태아의 등쪽을 위로 향하게 하고 척추의 경추 부분을 제거합니다. 다음으로, 등쪽 지방 침전물과 깊은 등 근육 결합 조직을 절제하십시오. 이제 수술용 집게를 사용하여 흉곽을 고정합니다.
미세 메스로 조심스럽게 긁어 주변 조직에서 깊은 등 근육을 분리합니다. PBS의 조직을 섭씨 4도의 12웰 세포 배양 플레이트에 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다. 더 오랜 기간 동안 섭씨 영하 80도의 빈 미세 원심분리기 튜브에 조직을 보관하십시오.
첫날에는 전체 epaxial 근육 덩어리를 사용하십시오. 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 3밀리리터의 저삼투압 완충액을 12웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 근육 조직 단편을 각 웰에 첨가하고 교반하면서 18 시간 동안 밤새 배양한다.
둘째 날에는 미세 팁 피펫으로 완충액을 제거합니다. 이제 매번 1 시간 교반하면서 3 밀리리터의 PBS로 샘플을 3 회 세척하십시오. PBS를 버린 후, 교반하면서 24시간 동안 3밀리리터의 0.05% SDS 세제 용액에서 샘플을 배양합니다.
셋째 날에는 미세한 팁 피펫을 사용하여 SDS 세제를 제거하고 매번 20분 동안 교반하면서 3밀리리터의 저삼투압 세척 완충액으로 조각을 세 번 세척합니다. 웰의 용액을 2 밀리리터의 DNase 용액으로 교체하고 섭씨 37도에서 교반하면서 3 시간 동안 조직 단편을 배양한다. DNase 용액을 제거한 후, 단편을 매번 20분 동안 교반하면서 3밀리리터의 PBS로 3회 세척하고, 마지막 세척을 밤새 방치한다.
subconfluent C2C12 세포로 시드 된 T-25 플라스크에 500 마이크로 리터의 트립신을 첨가하고 1 밀리리터의 완전한 배지에 재현 탁합니다. 현탁액 10 마이크로 리터와 트리판 블루 염료 10 마이크로 리터를 혼합하고 혈구 분석기에로드하여 세포 수를 계산하고 생존력을 추정합니다. 층류 후드에서 탈세포화된 매트릭스 또는 dECM을 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
마이크로 메스와 핀셋을 사용하여 매트릭스를 작은 조각으로 분리하십시오. 파편을 96웰 플레이트의 웰로 옮기고 웰당 3-4개의 조각을 배치합니다. 200 마이크로 리터의 예열 된 완전 배양 배지를 각 웰에 넣고 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양합니다.
웰 플레이트에 배지를 버리고 50, 000 개의 생존 가능한 C2C12 세포를 함유하는 완전한 배양 배지 200 마이크로 리터를 각 웰에 첨가한다. 웰 플레이트를 이틀 동안 인큐베이션한다. 세포와 함께 dECM을 400 마이크로리터의 완전한 배양 배지가 들어 있는 48웰 플레이트로 옮깁니다.
매트릭스 박리를 방지하기 위해 이틀마다 배지를 조심스럽게 흡인하고 8일째까지 신선한 배지로 보충합니다. 분화를 위해 완전 배양액을 분화 배지로 교체하고 12일까지 4일간 배양한다. 근육 조직은 분리 직후 붉은색을 띠었고 저삼투압 완충액에서 배양한 후 세포 용해로 인해 흰색으로 변했습니다.
SDS는 근육을 투명하게 만듭니다. DNase 처리 후, 더 작고 투명한 dECM이 얻어졌다. DNA 정량화는 천연 조직에 비해 dECM이 거의 100% 감소한 것으로 나타났습니다.
dECM과 천연 조직은 라미닌 알파 2와 라미닌 단백질에 대해 유사한 관형 염색을 나타냈습니다. 천연 조직의 웨스턴 블롯 분석은 라미닌 알파 2 서브유닛에 대해 2개의 밴드를 표시한 반면, dECM에서 3개의 더 작은 밴드가 검출되었습니다. 총 라미닌의 경우, dECM 샘플은 천연 조직과 비교할 때 단백질 단편화를 보여주었습니다.
피브로넥틴과 콜라겐 I은 천연 조직의 세포와 dECM 사이의 간질 공간에 존재했습니다. 유사한 피브로넥틴 밴드가 두 샘플 모두에 존재했으며, 이는 탈세포화의 영향을 받지 않음을 나타냅니다. dECM에서 더 적은 콜라겐 I 밴드가 관찰되었습니다.
콜라겐 IV의 경우, 두 샘플 모두 유사한 관형 염색을 나타내었다. 그러나, dECM 밴드의 분자량은 더 낮았다. C2C12 세포는 dECM에서 집락화 및 증식하여 다핵 근관으로 융합되었습니다.
이들은 분화 배지에서 4일간의 배양 후에 미오신 중쇄 단백질을 발현시켰다. 세포내 및 세포주위 염색은 라미닌 알파 2쇄, 총 라미닌 및 피브로넥틴에 대해 관찰되었다. 탈세포화된 태아 마우스 골격 스캐폴드는 공동 배양 시스템에서 세포를 성장시키는 데 사용할 수 있으며, 생체 내 상황에 더 가깝게 만들 수 있으므로 근육 질환을 이해하는 데 기여합니다.
