Esta técnica aumenta os níveis de glicose no líquido cefalorraquidiano ou no LCR em camundongos sem afetar sua concentração de glicose no sangue. Isso ajuda a investigar os efeitos diretos dos altos níveis de glicose no LCR na função cerebral do animal. Esta técnica pode estabelecer modelos animais para explorar o papel teológico da glicose mais elevada no LCR na disfunção cognitiva.
Levando à descoberta de novos alvos moleculares para melhorar a função cognitiva. O método também ajudará a determinar se altos níveis de glicose no LCR são suficientes para mediar fenótipos de doenças neurodegenerativas em camundongos. Deve-se atentar para a montagem e priming adequados da montagem da cânula e inserção da cânula no cérebro nas coordenadas corretas.
Para iniciar a cirurgia de Implante de Minibomba Osmótica coloque o mouse anestesiado sobre o quadro estereotáxico. Encaixe a cabeça do animal na barra do incisivo. Cubra o nariz com o cone nasal para manter a anestesia e conecte o fluxo de isofluorano ao cone nasal a uma taxa de 1,5 a 2% Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter a temperatura corporal.
Depois de desinfetar a área cirúrgica e fazer uma incisão, exponha a superfície do crânio com uma espátula e limpe o sangue, se houver, com pontas de algodão. Use um cauterizador se sangrar profusamente. Esfregue com uma ponta de algodão mergulhada em peróxido de hidrogênio a 3% para expor as suturas cranianas.
Trabalhando sob um microscópio, tome nota de bregma e lambda para navegar pelas coordenadas do crânio. Defina todas as coordenadas como zero no bregma. Usando uma furadeira elétrica cuidadosamente e sem romper a dura-máter faça um furo nas coordenadas 0,5 milímetros posterior ao bregma e 1 milímetro lateral à linha média em direção à direita.
Insira um hemostático e abra-o e feche suavemente para fazer um bolso para a mini bomba. Segurando a bomba a partir da ponta do modulador de fluxo, empurre-a através da pele incisada para o bolso criado. Aplique um pouco de cola na parte inferior da cânula e fixe-a no suporte da cânula.
Certifique-se de que a cânula não está entupida e que a solução está fluindo corretamente. Em seguida, abaixe a cânula lentamente através do orifício perfurado, dois milímetros ventral até a superfície do crânio. Deixe por pelo menos cinco minutos para que a cola se solidifique.
Com a ajuda de uma tesoura, prenda a parte superior da cânula garantindo que ela não se desloque da superfície do crânio. Cubra a cânula com uma camada de cimento dentário para um suporte extra. Para a coleta de líquido cefalorraquidiano ou LCR, coloque o mouse devidamente anestesiado no quadro estereotáxico.
Depois de fixar a cabeça no quadro, como demonstrado anteriormente, gire os botões para inclinar a cabeça de modo que o nariz fique voltado para baixo. Depois de desinfetar a área cirúrgica e fazer uma incisão, remova o suporte do corpo do mouse e deixe o mouse descansar verticalmente para que o pescoço fique totalmente estendido dorsalmente. Usando pinças rombas curvas, bissetriz suavemente os músculos posteriores do pescoço a partir da linha média para criar uma pequena janela.
Em seguida, use um aplicador de ponta de algodão molhado para deslocar suavemente os músculos do pescoço da linha média para a periferia. Observe se a cisterna magna está exposta como uma janela triangular com uma membrana dura transparente. Coloque o conjunto do micromanipulador na estrutura estereotáxica ao lado do mouse, garantindo que a ponta capilar não toque em nenhuma superfície.
Quebre suavemente a ponta capilar sem atrapalhar o setup. Gire os botões correspondentes no micromanipulador para alinhar lentamente e mover a ponta capilar em direção à cisterna magna. Alguma resistência é sentida quando a ponta capilar toca a membrana da cisterna magna.
Muito lentamente, empurre a ponta contra a membrana com a ajuda dos botões tomando cuidado para não danificar quaisquer vasos sanguíneos na membrana. À medida que a membrana é perfurada, o LCR flui para o capilar de uma só vez devido à pressão capilar negativa. Deixe o setup por alguns minutos até que aproximadamente 10 microlitros de líquor se acumulem no capilar.
Retire cuidadosamente o capilar da seringa e fixe-o a um dispensador de bulbo de microtampa. Pressione o bulbo para transferir o LCR para um tubo de microcentrífuga estéril. Coloque o suporte sob o mouse e gire os botões estereotáxicos para nivelar a cabeça.
Feche a ferida com suturas de nylon. Injetar 300 microlitros de soro fisiológico estéril por via subcutânea antes de retirar o camundongo do aparelho. Dar cuidados pós-operatórios aos animais até chegar a hora de retirar as suturas, cerca de 7 a 10 dias após a cirurgia.
O LCR coletado 10 dias após a cirurgia mostrou um aumento de cerca de seis vezes no nível de glicose em camundongos, infundido com glicose a 50% em comparação com o de camundongos infundidos com LCR. No entanto, os níveis glicêmicos não foram diferentes entre os grupos. Ao abaixar a cânula no cérebro, retraia-a e verifique se o LCR sai do buraco.
Também é vital identificar corretamente a cisterna magna e evitar a contaminação do LCR com sangue. Esta técnica também pode ser usada para entregar qualquer droga que é incapaz de atravessar a barreira hemato - encefálica para testar o seu efeito na função cerebral. Há um número muito limitado de modelos animais de diabetes, e eles perturbam a homeostase da glicose no ambiente periférico.
Esse modelo, no entanto, ajuda a investigar alterações cerebrais específicas na regulação da glicose sobre a função neural.
