Agradecemos ao Dr. Harvey Hensley por seu apoio técnico especializado. Este trabalho beneficiou da utilização dos seguintes Fox Chase Cancer Center (FCCC) instalações: Laboratório de Biotério e Facilidade de imagens de Pequenos Animais. Este trabalho foi financiado em parte pelo SPORE cancro do ovário em FCCC / UPenn (P50 CA083638), o FCCC núcleo de subvenção (P30 CA006927), e do ovário Cancer Research Fund.

I. Preparação das células do tumor de ovário <ol><li> Crescer linhas de células de câncer de ovário expressando luciferase na cultura. Fontes de luciferase pode ser Firefly, Renilla, ou outras espécies. Células que expressam proteínas fluorescentes também podem ser usados. Para esta demonstração, usamos uma linha de células de ovário de câncer, OVCAR5, expressando firefly luciferase. </li><li> Células colheita utilizando a técnica de cultura de células de rotina. </li><li> Manter a suspensão de células (10.000 células / mL) em tampão fosfato salino (PBS) em gelo até o momento da injeção. </li></ol> II. Injeção Intrabursal Este procedimento requer a assistência de uma segunda pessoa. Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados sob condições assépticas. Isto inclui vestindo trajes cirúrgicos estéreis e usando instrumentos cirúrgicos, seringas e agulhas. <ol><li> Prepare a solução anestésica através da mistura de 3 mL de cloridrato de cetamina (100 mg / mL), 1,6 mL de cloridrato de xilazina (100 mg / mL), 1,5 mL de acepromazina (10 mg / mL), e 20 mL de cloreto de sódio a 0,9%. </li><li> Verificar o número de identificação do animal e saúde observável. Anestesiar o animal com anestesia cetamina-xilazina-acepromazina preparados via injeção intraperitoneal (ip) com um volume de dose de 8 ~ 9 peso corporal mL / kg (BW). </li><li> Confirmar que o animal está sob uma planície aceitável de anestesia através da realização de uma pitada do dedo do pé com uma pinça ou dedos para patas traseiras do animal. Se houver pedal reflexo, esperar por uma profunda planície de anestesia até que o animal está respondendo a este procedimento. </li><li> Coloque o lado dorsal animais acima em uma gaze estéril com a cabeça virada para fora e sua cauda virada para você. O ponto de incisão está localizado à esquerda ou à direita da linha média e acima dos ovários. Barbear ou molhar a pele com álcool a 70% no ponto de incisão. </li><li> Levante a pele molhada com a pinça e fazer uma pequena incisão com a tesoura na posição dorsomedial e diretamente acima do bloco de ovário de gordura. A almofada de gordura de ovário devem ser visíveis por baixo da superfície da parede peritoneal. Almofada de gordura é facilmente reconhecível pela sua cor branca, em contraste com o tecido rosa escuro que o rodeiam. </li><li> Levante cuidadosamente o revestimento de parede peritoneal e fazer uma pequena incisão, tal como descrito acima (5). </li><li> Coloque uma compressa de gaze estéril embebida salina na linha média adjacente à incisão. Localize a almofada de gordura e de ovário puxe-o suavemente e descansar-lo para a gaze. Estabilizar o ovário apertando a almofada de gordura com um clipe de bulldog. Sob um microscópio de dissecação posição, o ovário a permitir a inserção da agulha (30 gauge, G) a tomada da curva túbulo oviduto levando à bursa. Quando a agulha é inserida na posição correta, deve-se visíveis sob a bursa. </li><li> Com cuidado, empurre o êmbolo da seringa para injectar 5 mL de suspensão celular entre a bursa e do ovário, enquanto a seringa é posicionado no sítio da injecção. Este passo requer duas pessoas. Uma pessoa empurra o êmbolo enquanto a outra pessoa mantém posicionamento da agulha. Retire a agulha rapidamente para selar o local da punção, mas com cuidado suficiente para não rasgar a bursa e túbulo. A bursa deve aparecer a ser ligeiramente distendido com injeção adequada. </li><li> Solte a almofada de gordura do clipe de bulldog e suavemente substituir o trato reprodutivo e volta almofada de gordura na cavidade peritoneal. Feche cuidadosamente a parede do corpo, puxando o revestimento superior sobre a inferior peritoneal forro. Feche a pele com grampos cirúrgicos ou clipes ferida. </li><li> Colocar o animal de volta se recuperando em sua gaiola e fornecer uma fonte de calor seguro para evitar a hipotermia e acelerar a recuperação. Monitorar a taxa de respiração e facilidade, o retorno do tônus ​​muscular, ea capacidade de se mover voluntariamente. Estes são todos os bons indicadores da progressão para a recuperação. Grampos ou clipes de ferida pode ser removido 7 ou mais dias pós-cirurgia. </li></ol> III. Administração Gavage Oral <ol><li> Use uma agulha de 18 ~ 20 G sonda gástrica ou tubo de alimentação com uma ponta arredondada. A agulha sonda não deve ter mais do que a distância da ponta da cabeça do animal para a sua última costela. </li><li> Verificar o número dos animais de identificação e de saúde observável. Suavemente scruff do animal, segurando a pele sobre os ombros com o polegar e os dedos. A contenção deve ser firme o suficiente apenas para os membros tona a ser estendido para cada lado e para fora do caminho. O animal não deve ser capaz de compreender na agulha. </li><li> Puxe para trás a cabeça do animal com o dedo indicador, formando uma linha reta através do pescoço e esôfago. Suporte para as costas do animal com o interior de seu polegar. </li><li> Suavemente e sem força, inserir a agulha gavagem em ambos os lados da boca e sobre a língua. Em um movimento suave, a agulha deve passar contra o céu da boca e para o esôfago. Gravidade deve guiar a agulha para baixo, sem encontrar resistência. Se houver alguma resisce, retire a agulha e começar de novo. Gag do animal e reflexo engolir pode ser desencadeada durante a inserção. No entanto, não deve haver nenhuma resistência ou ofegante do animal. É importante certificar-se que o animal está respirando quando a agulha está no local verificando o movimento das narinas e no peito. </li><li> Lentamente empurre o êmbolo da seringa para dispensar o volume dose. </li><li> Remova cuidadosamente a agulha gavage no mesmo ângulo e via como a forma como foi inserido para o esôfago. </li><li> Devolver o animal para sua gaiola e respiração monitorar e comportamento para 5 ~ 10 minutos. </li></ol> IV. In Vivo de imagem Usamos a Caliper Life Sciences para monitorar o comportamento de células injetadas na cavidade intrabursal. Experimentos usando este sistema normalmente têm um prazo de 4 a 16 semanas a partir do momento da implantação do tumor. <ol><li> Prepare a solução de D-luciferina (substrato de firefly luciferase), dissolvendo 5 ~ 20 mg em 1 mL de PBS e filtragem através de membrana 0,22 mm para esterilização. </li><li> Carregar a câmara de indução por ligar tanto o oxigênio eo gás isoflurano. Ligue o fluxo de gás para a câmara de indução apenas. A taxa de fluxo de isoflurano é mantida em um nível baixo até que os animais estão prontos para ser trabalhada. </li><li> Verificar o número dos animais de identificação e de saúde observável. Colocar o animal na câmara de indução acusado de gás isoflurano. </li><li> Remover o animal da câmara quando o animal parece estar anestesiado. Entregar 200 mL de solução de luciferina preparados via injeção ip com 30 agulha G. É importante registrar o tempo de injeção, a fim de manter o tempo consistente entre luciferina injeção e desempenho de imagem ao longo do estudo. </li><li> Coloque a volta de animais luciferina-injetado na câmara de indução. </li><li> Definir o sistema de imagem para as configurações adequadas. Certifique-se de inicializar o sistema antes de adquirir a imagem primeiro animal. </li><li> Desligue o fluxo de gás para a câmara de indução e ligar o fluxo de gás para a câmara de imagem. </li><li> Coloque o animal anestesiado dorsal ou lateral ventral para cima. Certifique-se de colocar o nariz dos animais em um cone de nariz para manter a indução da anestesia adequada. Verifique se o animal está dentro do &quot;ponto de grade de interesse&quot;, como indicado pela iluminação verde. </li><li> Feche a porta da câmara e adquirir a imagem no momento apropriado. Tempo pode ser determinada pela cinética. </li><li> Remover o animal da câmara de imagem e colocá-lo de volta para sua gaiola. Monitorar a recuperação dos animais conforme descrito em &quot;Injection Intrabursal&quot;. </li></ol> Representante Resultados V. <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Na geração de imagens Vivo de células tumorais de ovário em um modelo de camundongo ortotópico. OVCAR5 células que expressam luciferase foram injetados intrabursally em ovário direito e representado ao longo do tempo. Imagens foram obtidas 13 (esquerda), 17 (meio) e 22 (direita) dias após a injeção usando o sistema de imagem IVIS Spectrum. Lado dorsal é mostrado no painel superior e no lado ventral está no painel inferior. Note-se que a disseminação peritoneal de células tumorais 22 dias após a injecção. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Cuidados Fox Chase Cancer Center, Animal Institucional e Comitê de uso.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O câncer de ovário é a principal causa de morte entre todas as neoplasias malignas ginecológicas 1. A alta taxa de mortalidade desta doença é em grande parte devido ao seu diagnóstico tardio e à falta de métodos diagnósticos confiáveis ​​2. Além disso, a quimioterapia convencional, muitas vezes encontra quimiorresistência e recidiva de câncer 3. Portanto, o romance de terapêutica é necessária para efetivamente alvo desta doença. No desenvolvimento de novas terapias alvo o câncer de ovário humano, é fundamental para desenvolver um modelo animal representativo. Um modelo animal ortotópico tem vantagens em relação aos modelos convencionais xenoenxerto (por exemplo, subcutânea ou intraperitoneal injeções de células tumorais), em que 1) ele reproduz o principal local de formação de tumores, 2) que representa local comum de metástases, e 3) que proporciona células tumorais para interagir com microambiente apropriado 4, 5, 6, 7, 8. Os roedores possuem uma membrana única bursal que circunda o ovário e é contínua com o oviduto. Esta anatomia única de roedores permite a injeção de células tumorais de ovário ortotopicamente. Células tumorais injetadas Intrabursally ovário se comportam semelhante à doença humana, assim, crescendo dentro da membrana intrabursal e espalhando na cavidade peritoneal como progride tumor. Injeção de células luciferases estável expressando proteínas fluorescentes ou também permite que o comportamento de rastreamento de células tumorais em tempo real. Bioluminescentes e / ou tecnologia de imagens fluorescentes torna possível para as células repetidamente imagem tumor durante um longo período de tempo e estudo do crescimento do tumor, distribuição e regressão não-invasivo maneira 9, 10, 11. Ao estabelecer o modelo ortotópico, é fundamental para remover rapidamente a agulha da bursa após a injecção. Remoção abrupta dos selos agulha do local da punção e impede o vazamento de células injetadas. No entanto, ao mesmo tempo, o movimento deve ser suave para não rasgar o bursa. Se ocorrer uma fuga durante a injeção, pode levar as células a semente no abdômen e potencialmente confundir o estudo, ou seja, prematura se espalhando para fora do ovário. Neste caso, o animal específicas deve ser registrada e seguiu para o desenvolvimento de sites múltiplos tumor no peritônio antes do tratamento ou, alternativamente, eliminados das análises subseqüentes. Antes de realizar gavagem oral, é fundamental para verificar o comprimento do tubo de sonda através da medição da ponta da cabeça do animal para a última costela. É útil para marcar o tubo no nariz do animal e não passar o tubo passado esta marca. Inserção do tubo de passado esta marca pode resultar em uma perfuração no estômago. Determinação do comprimento do tubo é especialmente importante com os animais mais jovens ou animais com peso inferior a 20 g. Após a inserção da agulha sonda para o esôfago, deve haver nenhuma resistência ou luta do animal. É importante não para administrar a solução ou suspensão demasiado rápido, pois isso pode levar ao refluxo e, posteriormente, entregar o volume da dose imprecisos, bem como a adição de estresse para o animal. Para resultados de imagem comparável ao longo do tempo, é desejável para manter o tempo consistente entre a injeção de substrato luciferase e de imagem. O lapso de tempo pode ser determinada tomando série de imagens após a injeção de substrato e observar a cinética de sinais. Desenvolvimento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário, entrega oral da droga, e in vivo de imagens são técnicas necessárias para uma melhor compreensão do desenvolvimento e propagação do câncer de ovário e avaliar novos esquemas terapêuticos que pode vir a melhorar o resultado do paciente com esta doença mortal.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

Câncer humano e resposta ao tratamento é melhor representados em modelos animais ortotópico. Este artigo descreve o desenvolvimento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário, o tratamento de câncer através da entrega de medicamentos orais e monitoramento do comportamento de células tumorais em resposta ao tratamento medicamentoso em tempo real usando in vivo do sistema de imagem. Neste modelo ortotópico, células de ovário tumor expressar luciferase são aplicados topicamente, injetando-los diretamente na bursa mouse onde cada ovário é fechado. Após a injeção de D-luciferina, um substrato de firefly luciferase, luciferase células que expressam gerar sinais de bioluminescência. Este sinal é detectado pelo sistema de imagens in vivo e permite um meio não invasivo de monitorar o crescimento do tumor, distribuição e regressão em animais individuais. Administração de medicamentos via oral por gavagem permite um volume de dosagem máxima de 10 mL / kg de peso corporal a ser entregue diretamente ao estômago e se assemelha a entrega de drogas em tratamentos clínicos. Portanto, as técnicas descritas aqui, o desenvolvimento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário, entrega oral da droga, e in vivo de imagens, são úteis para uma melhor compreensão humana de câncer de ovário e tratamento e vai melhorar o direcionamento desta doença.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado por<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem do sistema.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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Vídeo: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Modelo rato ortotópico de câncer colorretal

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Biologia

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

Reestenose imagem In-Stent: Um Barato, modelo confiável, rápida e pré-clínicos

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Imagem de peróxido mitocondrial em células vivas de levedura usando mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa mitocondrial - biossensor mtHyper7 para análise subcelular 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...