A hibridização in situ é uma técnica muito informativa para apresentar padrões de expressão mRNA e IncRNA de genes específicos em tecidos. Nosso objetivo neste artigo é desenvolver um método sensível para detectar a localização específica do mRNA no fluido coelomico do Sipunculus nudus, que é um recurso de pesca crucial. Apresentamos os resultados representativos obtidos de nossos experimentos bem sucedidos usando este método.
Espera-se que nosso método seja aplicado a outras espécies de Sipuncula para identificar os padrões de expressão do mRNA específico e IncRNA em fluido coelomico. Fixar o nudus Sipunculus na mesa de dissecção. Abra o corpo do nudus Sipunculus com uma pequena tesoura autoclavada.
Em seguida, colete e transfira o fluido coelomico com pipeta para slides de microscópio tratados com poli-D-lysina, espalhe-se levemente. Seque as lâminas por uma hora a 37 graus Celsius. Lave os slides com DEPC-PBS por três vezes, cinco minutos por lavagem com agitação suave.
Escorra o PBS, adicione a solução proteinase K nos slides por cinco minutos à temperatura ambiente. Escorra a solução proteinase K. Adicione a solução PFA nos slides por 20 minutos em temperatura ambiente.
Drene a solução PFA. Lave os slides com DEPC-PBS por três vezes, cinco minutos por lavagem com agitação suave. Drene o PBS.
Adicione 50 microliter riboprobe. Adicione uma mancha de cobertura. Coloque os slides na caixa molhada e sele bem com filme de parafina.
Hibridize durante a noite a 60 graus Celsius. Mergulhe os slides no buffer de lavagem e deixe-o de pé até que a mancha de cobertura deslize automaticamente. Lave os slides com o tampão de lavagem pré-aquecido por duas vezes a 65 graus Celsius, 30 minutos por lavagem com agitação suave.
Lave os slides com a solução SSC pré-aquecido por duas vezes a 65 graus Celsius, 30 minutos por lavagem com agitação suave. Lave os slides com a solução MABT por duas vezes à temperatura ambiente. 30 minutos por lavagem com agitação suave.
Drene o MABT. Adicione o tampão de bloqueio. Incubar os slides em temperatura ambiente por três a quatro horas.
Escorra o tampão de bloqueio. Adicione o anticorpo, incubar os slides a 4 graus Celsius durante a noite. Drene a solução de anticorpos.
Lave os slides com a solução MABT por quatro vezes, 25 minutos por lavagem com agitação suave. Drene o MABT. Adicione o tampão de fosfattase alcalino por três vezes, cinco minutos por incubação.
Remova o tampão de fosfates alcalino. Adicione a solução de coloração BCIP-NBT. Mantenha os slides no escuro.
O tempo de coloração varia de minutos a horas, mesmo durante a noite, o que depende da intensidade do sinal. O estado de coloração deve ser verificado com mais frequência no início da coloração. Por exemplo, com um intervalo de vários minutos, e várias horas no máximo da coloração.
O tempo de verificação deve ser o mais curto possível para evitar a introdução de sinalização de fundo alta devido à exposição à luz. Os sinais representativos da hibridização in situ são mostrados. No situ hibridização do fluido coelomico Sipunculus nudus com riboprobe anti-sentido que tem como alvo o dmrt1 indica coloração roxa concentrada em células trophoblastos dos espermatozeumatos, figura 2A e B.Sense riboprobe para dmrt1 não detectou nenhum sinal de hibridização, figura 2C.
Depois de assistir a este vídeo, você teria uma compreensão muito boa de como visualizar os padrões de expressão de mRNA de destino ou IncRNA no fluido coelomico do Sipunculus nudus.
