Este trabalho foi financiado por concessões do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), o Peter Lougheed Medical Research Foundation, o Programa de McGill em Neuroengenharia, o Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), ea Fundação Canadense para Inovação (CFI ). Sébastien D. Langlois foi apoiada pelo Prêmio de Mestre de Formação do Fonds de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) e Frederick Banting por Charles e Prêmio de Melhor Canadá de Pós-Graduação Mestrado Bolsas de Estudo a partir do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Somos gratos a Jessica MT Pham de assistência com os números.

1. Dissecção da medula espinhal dorsal embrionárias de rato Recomendações gerais Mantenha L-15 médio no gelo e muitas vezes mudar o meio no prato dissecção para manter os embriões frescos. Isso ajuda a preservar a integridade dos tecidos. Todas as etapas são realizadas com duas pinças Dumont # 5 a menos que indicado. Para evitar a contaminação, spray todas as ferramentas e superfícies de trabalho com etanol 70% e manter a garrafa meio dissecção fechado. A transferência de embriões entre pratos, use uma pipeta de plástico recortado ou uma colher perfurada. É fundamental para não danificar a medula espinhal (nicking, alongamento) para completar com sucesso a dissecção. Preparação <ul><li> Frio L-15 de médio </li><li> 50 mL de L-15 + inativado pelo calor de 10% soro de cavalo (HiHS). Manter no gelo. </li></ul> Dissecção da medula espinhal <ol><li> Euthanize um E13 gravidez encenado rato (E0 = primeiro dia dia seguinte acasalamento) com uma câmara de CO 2 de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Spray de etanol a 70% sobre o abdome. Beliscar e puxar para cima a pele da região abdominal inferior com uma pinça e cortado com tesoura cirúrgica. Repita a operação para cortar o músculo e as camadas peritoneal para alcançar a cavidade abdominal. Criar uma incisão em forma de V, cortando o tecido ao longo dos lados do abdômen, até o tórax. Levante e puxe o tecido para expor a cavidade abdominal. </li><li> O útero é anexado em três locais: no abdômen inferior central, e em ambos os cantos superior lateral. Levante o útero, agarrando no tecido entre sacos embrionárias. Corte o tecido conjuntivo para remover o útero e coloque em um prato de Petri cheia de L-15 no gelo. </li><li> Os próximos passos são feitos sob um microscópio de dissecação. Para separar um embrião a partir de tecidos extra-embrionário e as membranas embrionárias, pegue o tecido entre sacos uterina com um par de fórceps,. Com o outro par, aperte o lado mais transparente do saco para cortar através das membranas superficial (o lado mais escuro é a placenta). Esprema o embrião pressionando suavemente o lado placenta do saco. Remova todos os embriões e coloque em um prato de Petri cheia de L-15 no gelo. </li><li> Embrião único lugar a 10 centímetros prato cheio de Petri gelada L-15. Usando microtesoura, cortar a cabeça e partes posterior em ângulos mostrados na figura 1a. Corte nestes ângulos irá ajudar a posicionar o embrião quando colocado &quot;face ventral para baixo&quot;. </li><li> Posição do embrião &quot;face ventral para baixo&quot; (anterior apontando para fora, posterior apontando para o experimentador) (fig. 1b). </li><li> Segure firmemente o embrião de um lado, usando a pinça para &quot;fechar&quot; o embrião (fig. 1c). Não mova a fórceps, uma vez que irá rasgar o tecido. Com o outro par de fórceps, retire a pele que cobre a parte traseira do embrião a partir da região entre a &quot;holding&quot; fórceps (fig 1d-e). Isto irá expor a medula espinhal que, neste momento, é envolto por membranas (as meninges). Agarre a pele dos lados em vez de acima da medula espinhal para evitar nicking da medula espinhal. </li><li> Parcialmente retirar o tecido para o lado direito da medula espinhal (fig. 1f). Começando ao nível do fórceps segurando, picar o tecido com uma pinça fechada, o mais próximo possível para a medula espinhal. Então, abra lentamente a pinça para rasgar o tecido. Isso deve retirar os gânglios da raiz dorsal (DRGs) da medula espinhal, e também deve atrapalhar os órgãos ventral. Deixe um pouco de tecido ligado nas extremidades anterior e posterior. Tecido Deixando anexado adiciona peso ao embrião, impedindo-o de ser puxado para cima durante a próxima etapa. Além disso, o tecido que é usado para segurar o embrião em etapas posteriores. </li><li> A partir do final anterior, use a agulha de tungstênio em forma de gancho para cortar as meninges e abra a medula espinhal ao longo do roofplate (fig. 1g). </li><li> Gire o embrião de 180 graus (posterior apontando para fora, apontando para o experimentador anterior) (fig. 1h). Isso permite que o pesquisador de utilizar a mesma mão para retirar o tecido do outro lado do embrião. </li><li> Segure o embrião agarrando-se ao lado anteriormente individual, e perturbar o tecido do lado restante usando o mesmo método (ver 1.8.). Quando terminar, retire completamente o tecido em ambos os lados da medula espinhal. Alternativa: separar completamente o tecido remanescente no lado esquerdo, mas deixar algum tecido em anexo no final anterior e posterior do lado direito. Isto às vezes pode ajudar a manter a coluna vertebral na posição no passo 1.12. </li><li> Coloque a medula espinhal do seu lado e remover a maioria do tecido remanescente mesenquimais e DRGs (fig. 1-I). </li><li> Nesta etapa, as meninges ea medula espinhal são duas &quot;folhas&quot; de tecido apposed para o outro. Pino para baixo o maior, porção ântero-a maior parte da medula espinhal, e descolar um pequeno segmento de meninges da cor da coluna vertebrald (fig. 1-J, à esquerda). Agora, segure os dois segmentos separados por agarrar todo com uma pinça, e descolar as meninges com um movimento suave e constante (fig. 1-J). Desigual &quot;peeling&quot; levará à ruptura da medula espinhal e / ou a camada de meninges. Geralmente não é possível recuperar a parte da medula espinhal ainda ligado ao meninges. </li><li> Usando uma pipeta, transferir o cabo isolado espinhal para uma placa de Petri contendo HiHS L-15 + 10% e deixar no gelo. Tipicamente, medula espinhal de todos os embriões são coletados antes de dissecar as porções dorsal. </li></ol> Dissecção medula espinhal dorsal <ol start="15"><li> Medula espinhal um lugar numa placa de Petri contendo L-15 HiHS +10%, deitado em um &quot;livro aberto&quot; de configuração. Cortar a maior parte, anterior (que inclui parte do cérebro posterior) (fig. 1k). </li><li> O tecido dorsal está localizado na parte mais lateral da medula espinhal (fig 1l, esquerda). Enquanto pinagem do cabo com uma agulha de tungstênio em linha reta, use a agulha de tungstênio em forma de L para cortar uma tira que é a largura 1/5th de metade da medula espinhal. (Fig. 1l, direita). Coloque as tiras dorsal em um tubo de plástico contendo 15 mL L-15 + HiHS 10% sobre o gelo. Dorsal seções do tubo neural de embriões E13 ~ 12 ~ renderá 3,5-4.000.000 células para revestimento após a dissociação. Mais células podem ser obtidas através da realização de uma dissecção grossa do cordão espinhal dorsal (corte mais largo tiras dorsal), mas a pureza de neurônios comissurais será reduzida. </li></ol> 2. Comissural cultura neurônio Recomendações gerais Todos os passos devem ser realizados em condições estéreis em uma capa de cultura de tecidos, salvo indicação contrária. Use meio fresco e suplementos recém-descongelado e reagentes. A dissociação e as etapas de trituração são realizados em Ca 2 + / Mg 2 + livre HBSS para minimizar Ca 2 + / Mg 2 + dependente de adesão. Preparação <ul><li> lamínulas revestido (uso de vidro Desag alemão) ou placas de cultura de tecidos (ver procedimento de revestimento abaixo). </li><li> quente Mídia Plating Neurobasal (veja abaixo), em pratos de cultura de tecidos e CO 2 equilibrado na cultura de tecidos incubadora de pelo menos 1,5 h antes do plaqueamento. </li><li> Tripsina 2,5% no banho-maria 37 ° C </li><li> 2 garrafas de HBSS Ca 2 + / Mg 2 + livre, um de 4 ° C, uma temperatura de 37 ° C. </li><li> dois-fogo de vidro polido pipetas Pasteur uma com um diâmetro de metade do tamanho normal, e um com um diâmetro ligeiramente menor que a metade. Use pipetas esterilizadas Pasteur. Ao fogo polonês as pipetas, use um bico de Bunsen (o topo da chama azul claro) para derreter a ponta para diminuir ligeiramente o diâmetro. Porque esta etapa é realizada fora do capô de cultura de tecido, spray as pipetas com etanol 70% antes de colocar sob o capô cultura de tecidos. Para uma recuperação mais eficiente dos neurônios, o revestimento do pipetas Pasteur com a mídia contendo soro antes do início da dissociação ou apenas antes da etapa de trituração (preencher pipetas com a mídia e manter por 30 segundos). Isso vai evitar que as células de degola para o interior da pipeta Pasteur durante a trituração. </li><li> água MilliQ estéril para lavar PLL revestido pratos ou lamelas </li><li> 12,5% MgSO 4 em solução HBSS </li></ul> Poli-L-lisina revestimento Se estiver usando lamínulas de vidro, ácido lavagem por 24 horas e esterilizar antes de chapeamento (ver Kaech e Banker, 2006). Use lamínulas de vidro alemão Desag. Para o revestimento de poli-L-lisina em lamínulas de vidro ou placas de cultura de tecido de plástico: <ul><li> sob uma capa de cultura de tecidos, cobrir superfícies com uma pequena cúpula de 100 ug / ml solução PLL para 1,75-2 horas. </li><li> lavar duas vezes com água MilliQ, pelo menos 5 minutos por lavagem (pode ser realizada durante a etapa de dissociação de células abaixo). </li><li> armazenamento em água até o uso. Não deixe que a superfície PLL revestido seco. Para reduzir o desperdício de PLL para o revestimento de lamelas, coloque as lamelas em estéril pratos bacteriana Petri. Brasão e lavar as lamelas, colocando uma cúpula de líquido no lamínulas. Os pratos bacteriana Petri são hidrofóbicos, de modo que o líquido deve permanecer no lamínulas de vidro. Transferir as lamelas para placas de cultura de tecidos logo antes do plaqueamento das células. Para os neurônios semeadas em placas de cultura de tecido de plástico, a adesão é normalmente mais elevada, alongamento, assim, neurite poderiam ser diminuídos. </li></ul> Dissociação e chapeamento <ol><li> Verifique se as tiras dorsal ter resolvido até o fundo do tubo. Remover a maioria dos HiHS L-15 +10% com uma pipeta Pasteur. Rapidamente lavar a dorsal tiras do tubo neural, uma vez adicionando 3 ml de frio (4 ° C) HBSS. </li><li> Deixe o dorsal tiras do tubo neural se contentar com dois minutos, depois remover o HBSS com uma pipeta Pasteur. </li><li> Adicionar quente (37 ° C) HBSS a um volume de 4,7 ml. Tgalinha adicionar 0,3 ml de tripsina 2,5% para dar uma concentração final de tripsina 0,15%. </li><li> Incubar a 37 ° C em banho-maria por 7 min. Misture delicadamente uma vez a meio da incubação. </li><li> Adicionar 30 mL DNAse (25 000 U / mL) para uma concentração final de 150 U / mL. Adicionar 60 mL de MgSO 4 e misture rapidamente, para uma concentração final de 0,15%. Para o tecido de dissecção grossa, incubar por um minuto extra de 1 a 37 ° C em banho-maria. Nesta fase, o dorsal seções de tubo neural devem ser fragmentado. Se o dorsal seções do tubo neural não ter começado a se fragmentar, isso normalmente significa que o estoque de tripsina 2,5% é velho, e novas ações devem ser descongeladas, ou a lavagem com HBSS frio não retirar o HiHS da amostra. </li><li> Centrifugar os fragmentos de tecido em 200 g por 4 min. </li><li> Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, deixando ~ 5-10 mL de líquido no fundo do tubo. </li><li> Flick suavemente o tubo para soltar a pelota, em seguida, lave as células, adicionando 5 ml de HBSS quente. Vamos resolver em temperatura ambiente por 2 min. </li><li> Centrifugar a 200 g por 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, deixando ~ 5-10 mL de líquido no fundo do tubo. </li><li> Flick suavemente o tubo para soltar a pelota e parcialmente ressuspender as células. Em seguida, adicione 2 ml de HBSS quente. </li><li> Use o pequeno (diâmetro meia)-fogo de vidro polido pipeta Pasteur para dissociar as células por pipetagem lentamente para cima e para baixo 4-6 vezes. Evitar fazer bolhas, e pipetar o líquido contra a parede do tubo. Não excesso de triturar. </li><li> Use o menor-fogo de vidro polido pipeta Pasteur para continuar a dissociar as células por pipetagem lentamente para cima e para baixo 3-4 vezes. Evitar fazer bolhas, e pipetar o líquido contra a parede do tubo. Não excesso de triturar. Para o tecido de dissecção grossa, adicionar um ml um extra de HBSS quente para o tubo no final da dissociação. Ao dissociar as células, não é necessário dissociar todos os aglomerados de células e agregados. Parar pipetando para cima e para baixo ou mudar para uma pipeta Pasteur com um diâmetro menor, se você não vê nenhuma redução ainda maior no tamanho dos agregados de células com mais de pipetagem. </li><li> Que qualquer fragmento de tecido restantes se estabelecer no tubo durante 1 min. Não é necessário transferir as células para um novo tubo. </li><li> Tome 20 l da suspensão celular e adicionar 5 mL de azul de tripano. Contagem de células em um hemocitómetro. Neurônios deve ser ≥ 95% viáveis ​​por exclusão do azul tripan. </li><li> Placa de neurônios no Media Plating Neurobasal (veja receitas abaixo). <ul><li> Sugeridos para a obtenção de densidades plating neurônios isolados (culturas de baixa densidade para evitar a aglomeração de neurônios ou sobrepostos uns aos outros): </li><li> 120 000 - 180 000 células / poço de uma placa de 6 bem </li><li> 60 000 - 75 000 células / poço de uma placa de 12 poços </li></ul></li><li> 16-18 horas mais tarde, mudar a mídia para mídia Crescimento Neurobasal (veja receitas abaixo) Não use uma bomba de vácuo para aspirar a mídia da placa de cultura quando se muda de mídia; delicadamente use uma pipeta. Isto evita o desprendimento de neurônios. </li></ol> Resultados representativos: Quatro horas após o plaqueamento, os neurônios devem ter aderido à poli-L-lisina (PLL) revestido de superfície. Sob iluminação de contraste de fase, corpos celulares aderidos são tipicamente relativamente plana e de formato oval (fig. 2a). Células que não têm bem aderidas aparecem como esferas que se movem levemente quando o prato é muito gentilmente bateu na lateral. Muitos fatores podem potencialmente impedir a adesão de células (ver discussão). Após 30 horas in vitro, a maioria dos neurônios estenderam um axônio com um cone de crescimento visível (fig. 2c, d). Se o crescimento axonal pobres é observado, verifique se o meio de crescimento Neurobasal foi feito com meio fresco e suplementos. Neurônios permanecem saudáveis ​​por pelo menos seis dias nestas condições. Este procedimento tem se mostrado confiável rendimento preparações altamente enriquecido em neurônios comissurais, com 90% de neurônios expressando DCC (Yam et al. 2009). A largura da faixa de medula espinhal dorsal que é usado para preparar a suspensão de células irá afetar a pureza da cultura, com maior pureza, quando tiras mais finas são utilizadas. Um exemplo de aplicação é mostrado na figura 3 (imunofluorescência). Ver o artigo de Yam et al. (2009) para mais exemplos. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schematics de passos dissecção da medula espinhal. D = dorsais, V = Ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">Clique aqui para ver uma figura maior.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultado Representante da comissural isoladoneurônios semeadas em uma lamela de vidro PLL-revestido. a, b) 4 horas após o plaqueamento, os neurônios têm aderido à superfície. Bar = 20 mM. c, d) 30 horas após o plaqueamento, a maioria dos neurônios ter estendido um axônio com um cone de crescimento visível. Bar = 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um neurônio comissural histoquímica para gama-tubulina (verde), com F-actina marcados por phalloidin (F-actina, vermelho) eo núcleo por DAPI (azul). Receitas e comentários Neurobasal Mídia Plating <ul><li> Neurobasal </li><li> 10% inativadas pelo calor FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-glutamina (de 200 mM solução estoque) Opcional: antibióticos penicilina / estreptomicina (use metade da concentração normal) </li></ul> Neurobasal Mídia Crescimento <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 de diluição do estoque) </li><li> 2 mM L-glutamina (de 200 mM solução estoque) </li><li> Opcional: antibióticos penicilina / estreptomicina (use metade da concentração normal) Uma vez que a mídia é feita, ela pode ser mantido a 4 ° C por duas semanas. Para equilibrar a temperatura eo pH dos meios de comunicação antes do plaqueamento das células, a mídia local em pratos de cultura de tecidos Petri e coloque em uma cultura de tecidos incubadora de pelo menos 1,5 horas. </li></ul> Neurobasal Depois de uma garrafa de meio Neurobasal foi aberto, ele pode ser mantido por um mês a 4 ° C no escuro. Dispor de Neurobasal que foi aberta há mais de um mês, a sobrevivência da célula será menor. Inativado pelo calor soro fetal bovino (HiFBS) ou soro de cavalo (HiHS) Para aquecer-inativar calor FBS ou HS, a 56 ° C em banho-maria por 30 minutos. Agitar o frasco aproximadamente a cada 10 minutos ou assim. (Para maior precisão utilizar um frasco de tamanho semelhante cheio de água. Coloque um termômetro na garrafa de água para ver quando 56 ° C seja atingida. Inicie o tempo neste momento.) Inativadas pelo calor FBS pode precisar de ser centrifugadas para eliminar precipitados e pode ser aliquotado e re-congeladas a -20 ° C. L-Glutamina Descongelar sempre uma nova porção da L-glutamina para cada experimento. B27 Alíquotas de B27 pode ser mantida a 20 ° C para o armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C por até um mês.

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	<li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li><li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc.">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li><li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression.">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons.">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li><li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical,+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway.">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li></ol>

Nós descrevemos um método para dissecar e cultura neurônios comissurais do cordão espinhal de ratos embrionárias. Este procedimento tem sido utilizado rotineiramente em nosso laboratório para preparar os neurônios de forma confiável para estudar os mecanismos celulares e moleculares de orientação axônio. Para a biologia celular e experimentos imunoquímica, a dissecção de uma ninhada produz neurônios suficientes. Quando as células são mais necessários, como em muitos experimentos de bioquímica, dissec?...

Dissecção da medula espinhal dorsal embrionárias de rato (ver também Quadro I) <ul><li> E13 gravidez encenado rato </li><li> Etanol 70% </li><li> Tesoura cirúrgica, Ferramentas Ciência Belas </li><li> Fórceps, Dumont # 5, Ferramentas Ciência Belas </li><li> Placas de Petri </li><li> L-15 de médio </li><li> Microscópio de dissecção, Leica </li><li> Plástico pipetas de transferência </li><li> Microtesoura, Ferramentas Ciência Belas </li><li> Agulhas de tungstênio e retentores de pinos (uma agulha em forma de gancho, uma agulha L-formas, uma agulha), Ferramentas da Ciência Belas </li><li> Inativado pelo calor soro de cavalo (HiHS) </li><li> 15 ml de tubos de plástico </li></ul> Comissural neurônio cultura (ver também Quadro I) <ul><li> Tecido incubadoras cultura (37 ° C, umidade 5% CO 2, controlada) </li><li> Alemão Desag lamínulas de vidro e / ou placas de cultura de tecido de plástico </li><li> Poli-L-lisina, Sigma </li><li> Estéril MilliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Inativado pelo calor soro fetal bovino (HiFBS) </li><li> L-Glutamina </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penicilina / estreptomicina antibióticos </li><li> Banho-maria 37 ° C </li><li> Pasteur estéril Pipettes </li><li> Bunsen queimador de gás </li><li> HBSS, Ca 2 + / Mg 2 + livre, Invitrogen </li><li> DNAse, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Centrifugador </li><li> Hemocitômetro </li><li> Solução Azul Trypan </li></ul>

dissection and culture of commissural neurons from embryonic spinal cord

Neurônios comissurais têm sido amplamente utilizados para investigar os mecanismos subjacentes a orientação dos axônios durante o desenvolvimento embrionário medula espinhal. Os corpos celulares desses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e seus axônios seguem trajetórias estereotipados durante o desenvolvimento embrionário. Axônios comissurais inicialmente para o projeto ventralmente floorplate. Depois de cruzar a linha média, esses axônios vez anteriormente e projeto para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pela ação de várias pistas de orientação. Culturas altamente enriquecido em neurônios comissurais são ideais para muitas experiências abordando os mecanismos de pathfinding axônio, incluindo ensaios de torneamento, imunoquímica e bioquímica. Aqui, nós descrevemos um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Em primeiro lugar, a medula espinhal é isolado e tiras dorsal são dissecados. O tecido é então dissociado dorsal em uma suspensão de células por tripsinização e perturbação mecânica. Neurônios são banhados em lamínulas poli-L-lisina-revestido de vidro ou de cultura de tecidos de pratos. Após 30 horas<em&gt; In vitro</em&gt;, A maioria dos neurônios ter estendido um axônio. A pureza da cultura (Yam<em&gt; Et al.</em&gt; 2009), geralmente mais de 90%, pode ser avaliada por imunomarcação com o comissural DCC marcadores neurônio, LH2 e tag1 (Helms e Johnson, 1998). Esta preparação neuronal é uma ferramenta útil para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudos dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação durante o desenvolvimento da medula espinhal.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Research

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Neuroscience

16.7K visualizações.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal. Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.

Vídeo: Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neurociência

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...