Os autores agradecem imensamente o apoio dos prêmios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) e EP/N026683/1 (A.L., T.P.H.) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas - Laboratórios de Ciência e Tecnologia de Defesa (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Os dados que suportam esta publicação estão disponíveis em: 10.25405/data.ncl.22232452. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Autor Aceito do Manuscrito que surgir.

1. Tampão de lisado celular e preparação do meio
<ol><li>Preparo de 2x ágar YT+P e meio<ol><li>Preparar 2x ágar YT+P medindo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L de 1 M K 2 HPO4, 22 mL/L de 1 M KH2PO4 e 15 g/L de ágar. Para o caldo 2x YT+P, siga a composição anterior, mas omita o ágar.</li>
		<li>Esterilizar autoclavando a 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do buffer S30A<ol><li>Preparar o tampão S30A com 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato e 25 mL/L de Tris 2 M, ajustado para pH 7,7 com ácido acético.</li>
		<li>Conservar o tampão S30A a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do tampão S30B<ol><li>Preparar o tampão S30B com 5,88 g/L Mg-glutamato e 12,195 g/L K-glutamato, ajustado para pH 8,2 com Tris 2 M.</li>
		<li>Conservar o tampão S30B a 4 °C durante até 1 semana.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação do lisado celular (protocolo de 4 dias)
<ol><li>Dia 1<ol><li>Despeje o 2x YT+P em placas de ágar suplementadas com 100 μg/mL de ampicilina.</li>
		<li>Streak E. coli a partir de -80 °C estoque de glicerol, e incubar durante a noite a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Inocular uma única colônia da placa 2x YT+P em 400 mL de caldo 2x YT+P (suplementado com ampicilina) em um balão defletor de 1 L.</li>
		<li>Incubar durante 24 h a 37 °C com agitação a 220 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3<ol><li>Medir e registrar o OD600 das culturas de 24 h; o crescimento é suficiente em um OD600 de 3-4. NOTA: Tomar uma alíquota de 1 mL de cultura bacteriana e realizar uma diluição seriada com meio (2x caldo YT+P) antes de medir o OD600 nm. Ter em conta o efeito de diluição no cálculo do OD600.</li>
		<li>Transfira a cultura uniformemente entre frascos de centrífuga de 500 mL pré-resfriados.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Durante a centrifugação, complete a preparação do tampão S30A adicionando 2 mL/L de TDT 1 M ao tampão S30A previamente preparado, misturando e mantendo o tampão no gelo.</li>
		<li>Ressuspender os pellets de células em 200 mL de tampão S30A.</li>
		<li>Vórtice os frascos vigorosamente até que todo o pellet esteja completamente solubilizado, mantendo as células no gelo o máximo possível.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.5-2.3.7 (inclusive).</li>
		<li>Adicionar 40 mL de tampão S30A a cada frasco de centrífuga, ressuspender os pellets e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL pré-pesados.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g por 15 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e remova o sobrenadante residual por pipeta, mantendo-o no gelo o máximo possível.</li>
		<li>Pese novamente os tubos da centrífuga, registre a nova massa e calcule a massa dos pellets.</li>
		<li>Congele os pellets em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 4<ol><li>Descongele os pellets no gelo.</li>
		<li>Por 1 g de pastilha, adicionar o seguinte: 1,2 ml de tampão S30A (TDT adicionado antes da utilização), 275 μL de inibidor de protease (8 mM stock) e 25 μL de lisozima (10 mg/ml stock).</li>
		<li>Vórtice vigorosamente até que os pellets estejam completamente solubilizados sem grumos remanescentes, mantendo-os no gelo tanto quanto possível.</li>
		<li>Em tubos de centrífuga de 50 mL, sonicar as suspensões celulares a 120 W, 20 kHz, 30% de amplitude e pulsos liga/desliga de 20 s/40 s por 5 min de sonicação.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g por 1 h a 4 °C para pellet os detritos celulares.</li>
		<li>Transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga frescos de 50 mL.</li>
		<li>Incubar tubos a 37 °C a 220 rpm durante 80 min.</li>
		<li>Preparar materiais de diálise adicionando 1 mL/L de TDT 1 M ao tampão S30B. Misture e adicione 900 mL a um copo estéril de 1 L. Adicione um agitador magnético e mantenha-o a 4 °C.</li>
		<li>Após a reação de escoamento, transferir o extrato celular da etapa 2.4.7 para tubos de microcentrífuga de 2 mL e centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolidar o sobrenadante sem pellets no gelo em um tubo centrífugo de 50 mL.</li>
		<li>Determinar o volume total de extrato celular produzido e hidratar o número necessário de de diálise de 10K MWCO submergindo-os em S30B por 2 min.</li>
		<li>Carregar os através de uma seringa com até 3 mL de extrato. Diálise até três por copo de 1 L, agitando a 4 °C durante 3 h.</li>
		<li>Após a diálise estar completa, o que esclarece o extrato, transfira o extrato para tubos de microcentrífuga de 2 mL. Centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolidar o extrato clarificado em um tubo de centrífuga fresco sobre gelo e vórtice brevemente para misturar.</li>
		<li>Determinar a concentração de proteína do extrato usando um fluorômetro.</li>
		<li>Diluir o extracto até uma concentração de 44,5 mg/ml utilizando ddH2O pré-refrigerado.</li>
		<li>Alíquota em alíquotas de 200 μL, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação de hidrogéis liofilizados (Método A)
<ol><li>Pesar 0,75 g de agarose, adicionar ddH2O a um volume de 100 mL e micro-ondas em rajadas de 30 s em altas temperaturas para criar caldo de agarose derretida.</li>
	<li>Usando uma pipeta, transfira 50 μL de agarose fundida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixe o gel polimerizar por 20-30 min (a polimerização ocorre mais rapidamente se os géis forem transferidos para uma geladeira).</li>
	<li>Congelar os tubos de microcentrífuga, contendo os géis polimerizados, em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Remova a tampa dos tubos da centrífuga, cubra as aberturas do tubo da centrífuga com filme de cera e perfure a película várias vezes com uma ponta de agulha ou pipeta.</li>
	<li>Transfira os tubos de microcentrífuga contendo os géis polimerizados para armazenamento de −80 °C por 1-2 h.</li>
	<li>Recupere os tubos de centrífuga do armazenamento de -80 °C e coloque em um liofilizador, garantindo que os tubos estejam completamente secos.</li>
	<li>Acione o liofilizador com as seguintes configurações: temperatura: -20 °C, pressão: 0,1 mbar.</li>
	<li>Deixe o gel liofilizar durante a noite.</li>
	<li>Recupere os géis do liofilizador e coloque-os em armazenamento de -80 °C até que seja necessário. NOTA: Os géis podem ser armazenados liofilizados por até 1 ano.</li>
</ol>4. Preparação do estoque de solução energética 14x
<ol><li>Combinar todos os componentes da reação (Tabela 1) em um tubo de centrífuga de 15 mL sobre gelo para produzir uma solução de energia de 14x.</li>
	<li>Aliquot a solução de energia 14x em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazenar a -80 °C (alíquotas de menor volume podem ser usadas). NOTA: A solução de energia 14x pode ser armazenada durante vários meses a -80 °C se for evitado o congelamento-descongelamento repetido dos tubos.</li>
</ol>5. Preparação do estoque de aminoácidos 4x
<ol><li>Descongele, no gelo, todos os 20 componentes de aminoácidos de um kit RTS Amino Acid Sampler. Vórtice os aminoácidos para garantir que eles estão completamente dissolvidos.</li>
	<li>Em um tubo de centrífuga de 50 mL, combinar todos os 20 aminoácidos e adicionar 12 mL de vórtice ddH2O. estéril até que a solução fique clara, com apenas uma leve névoa de coloração branca.</li>
	<li>Aliquot os aminoácidos 4x em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (alíquotas de 500 μL).</li>
	<li>Congele rapidamente as alíquotas da solução de aminoácidos 4x em nitrogênio líquido e mova as alíquotas para armazenamento de -80 °C.</li>
</ol>6. Calibração do tampão livre de células
NOTA: O tampão CFPS usado para as reações de hidrogel foi calibrado para as concentrações ótimas de TDT, Mg-glutamato e K-glutamato seguindo o protocolo de Banks et al.34 modificado de Sun et al.35. As composições das reações de calibração foram selecionadas pelo método de planejamento de experimentos (DOE), sendo selecionados sete níveis fatoriais para K-glutamato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) e TDT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) estoques. O JMP Pro 15 foi usado para gerar um desenho DOE personalizado (Tabela 2) e conduzir a análise para determinar as concentrações ótimas dos fatores.
<ol><li>Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo.</li>
	<li>Descongelar os aminoácidos 4x, solução energética 14x, PEG-8000 40%, DNA plasmidial, 3 M K-glutamato, 100 mM Mg-glutamato e 100 mM TDT estoques no gelo.</li>
	<li>Crie uma mistura mestre de calibração combinando 12,5 μL dos aminoácidos 4x, 3,57 μL da solução energética 14x, 2,5 μL de PEG-8000 a 40%, 3 μg de DNA plasmidial e 10 μL de extrato livre de células (44,5 mg/mL) e faça até 35 μL por reação com ddH2O.</li>
	<li>Distribua os 35 μL da mistura mestra nos poços de uma placa preta de microtitulação de 384 poços.</li>
	<li>Seguindo o desenho do DOE, adicione o volume apropriado de Mg-glutamato, K-glutamato e TDT a cada reação, juntamente com ddH2O para fazer com que cada reação atinja 50 μL.</li>
	<li>Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas (para mCherry): excitação: 587 nm, emissão: 610 nm, largura de banda de comprimento de onda: 12 nm, óptica: topo, temperatura: 37 °C, com leituras de fluorescência sendo coletadas a cada 5 min por 4 h de tempo total de leitura. Incubar as placas com agitação em uma configuração pulsada a 60 rpm.</li>
	<li>Carregue os resultados no projeto JMP DOE e gere um perfil de previsão para determinar os níveis ideais de concentração para K-glutamato, Mg-glutamato e TDT com base nas variáveis de resposta desejadas; Neste caso, a fluorescência máxima e a taxa de reação foram as variáveis resposta.</li>
	<li>Combine os reagentes conforme mostrado na Tabela 3 para criar o buffer CFPS 2X</li>
	<li>Alíquota e armazenamento a -80 °C</li>
</ol>7. CFPS em hidrogéis liofilizados reidratados (Método A)
NOTA: Os plasmídeos utilizados nas reações de CFPS foram criados usando componentes da ferramenta modular EcoFlex para E. coli36 e descritos em Whitfield et al.11 O mCherry e o eGFP estavam sob o controle do promotor JM23100 constitutivo. Esses componentes estão disponíveis no Addgene.
<ol><li>Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 min.</li>
	<li>Coletar o tampão CFPS 2x e o DNA plasmidial e descongelar no gelo.</li>
	<li>Recolha os hidrogéis liofilizados e deixe-os atingir a temperatura ambiente durante 15 minutos, deixando os géis em pé no banco.</li>
	<li>Transfira os géis para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, aparando os géis com bisturi, se necessário, para que caibam nos poços.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combinar 10 μL de extrato livre de células com 25 μL de tampão 2x CFPS e 4 μg de DNA plasmidial; perfazer um volume total de 50 μL com ddH2O para criar a solução CFPS.</li>
	<li>Pipetar a solução CFPS para os hidrogéis liofilizados.</li>
	<li>Deixe os géis de molho no sistema CFPS por 5-10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira os géis para uma placa de microtitulação preta de 384 poços usando uma espátula.</li>
	<li>Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas na etapa 6.6. Resultados representativos estão disponíveis em estudos prévios31,33.</li>
</ol>8. Síntese de proteínas livres de células em hidrogéis destacáveis (Método B)
<ol><li>Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 minutos.</li>
	<li>Coletar o DNA plasmidial e descongelar no gelo.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sobre gelo, combinar 10 μL de extrato livre de células com 3 μg de DNA plasmidial e 25 μL de tampão 2x CFPS, perfazendo um volume total de 37,5 μL.</li>
	<li>Meça 3 g de agarose e adicione a 100 mL de tampão ddH2O para criar 3% de agarose.</li>
	<li>Micro-ondas a 3% agarose em 30 s explosões em alta potência.</li>
	<li>Pipetar 12,5 μL de agarose fundida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo mistura de CFPS para um volume total de 50 μL.</li>
	<li>Deixe a agarose fundida arrefecer, mas não polimerize, deixando a agarose num bloco térmico regulado para 50 °C.</li>
	<li>Combinar a agarose fundida com a solução CFPS; misturar através de pipetagem e agitação com a ponta, e certifique-se de mover-se rapidamente para evitar a polimerização em gel antes que a solução CFPS possa ser misturada.</li>
	<li>Deixe os géis arrefecerem à temperatura ambiente e polimerizem durante aproximadamente 2 min.</li>
	<li>Transferir a agarose polimerizada para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com espátula e congelar em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Coloque os hidrogéis congelados em -80 °C durante 1 h.</li>
	<li>Recuperar os géis do armazenamento; Remova as tampas dos tubos de microcentrífuga, cubra os tubos com filme de cera e perfure o filme para permitir que a umidade seja seca.</li>
	<li>Acione o liofilizador com as seguintes configurações: temperatura: -20 °C, pressão: 0,1 mbar, liofilização por 18 h (durante a noite).</li>
	<li>Conservar os dispositivos CFPS liofilizados em armazenamento de -80 °C até à utilização.</li>
	<li>Os dispositivos CFPS liofilizados, com um volume úmido aproximado de 50 μL, podem ser reidratados com 50 μL de ddH2O sem excesso de líquido. A reidratação leva aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Transfira os géis para uma placa de microtitulação preta de 384 poços usando uma espátula.</li>
	<li>Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas na etapa 6.6. Resultados representativos estão disponíveis em publicações anteriores31,33.</li>
</ol>

Incorporando reações de CFPS em uma variedade de matrizes de hidrogel

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine.">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li><li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels:+from+material+resources,+properties+to+functional+applications.">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).</li><li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials:+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150 (2020).</li><li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity.">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li><li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display.">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution.">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels.">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+DNA+hydrogel:+Design,+synthesis+and+applications.">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).</li><li>Howard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Datasets+for+Whitfield+et+al.">Datasets for Whitfield et al.</a> 2020 Chemical Communications. , (2020).</li><li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions.">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoFlex:+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology.">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li><li>Ben&#237;tez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+&#181;-channels.">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel &#181;-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li></ol>

Aqui são descritos dois protocolos para a incorporação de reações CFPS baseadas em lisado celular de E. coli em hidrogéis de agarose. Esses métodos permitem a expressão gênica simultânea em todo o material. O protocolo pode ser adaptado para outros sistemas CFPS e tem sido conduzido com sucesso com kits CFPS disponíveis comercialmente, além dos lisados celulares preparados em laboratório detalhados aqui. É importante ressaltar que o protocolo permite a expressão gênica na ausência de uma fase l?...

A biologia sintética integra diversas disciplinas de engenharia para projetar e projetar peças, dispositivos e sistemas de base biológica que podem executar funções que não são encontradas na natureza. A maioria das abordagens da biologia sintética ainda está ligada a células vivas. Por outro lado, sistemas de biologia sintética livres de células facilitam níveis sem precedentes de controle e liberdade no projeto, permitindo maior flexibilidade e um tempo reduzido para a engenharia de sistemas biológicos, ao mesmo tempo em que eliminam muitas das restrições dos métodos tradicionais de expressão gênica baseados em células 1,2,3. A CFPS está sendo usada em um número crescente de aplicações em várias disciplinas, incluindo a construção de células artificiais, prototipagem de circuitos genéticos, desenvolvimento de biossensores e produção de metabólitos 4,5,6. A SDFC também tem sido particularmente útil para a produção de proteínas recombinantes que não podem ser prontamente expressas em células vivas, como proteínas propensas à agregação, proteínas transmembrana e proteínas tóxicas 6,7,8.
A CFPS é tipicamente realizada em reações líquidas. Isso, no entanto, pode restringir sua implantação em algumas situações, já que qualquer dispositivo livre de células líquidas deve estar contido dentro de um recipiente de reação. A justificativa para o desenvolvimento dos métodos aqui apresentados foi fornecer protocolos robustos para incorporar dispositivos de biologia sintética livres de células em hidrogéis, não como uma plataforma de produção de proteínas em si, mas, em vez disso, permitir o uso de hidrogéis como um chassi físico para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório. O uso de hidrogéis como chassi CFPS tem várias vantagens. Os hidrogéis são materiais poliméricos que, apesar de apresentarem alto teor de água (às vezes superior a 98%), possuem propriedades sólidas 9,10,11. Têm uso como pastas, lubrificantes e adesivos e estão presentes em produtos tão diversos como lentes de contato, curativos, fitas adesivas marinhas, corretivos de solo e fraldas infantis 9,11,12,13,14. Os hidrogéis também estão sob investigação ativa como veículos de entrega de drogas 9,15,16,17. Os hidrogéis também podem ser biocompatíveis, biodegradáveis e possuir respostas a estímulos próprios9,18,19,20. Portanto, o objetivo aqui é criar uma sinergia entre a funcionalidade derivada da biologia molecular e a ciência dos materiais. Para tanto, esforços têm sido feitos para integrar a biologia sintética livre de células com uma variedade de materiais, incluindo colágeno, laponita, poliacrilamida, fibrina, peptídeo PEG e agarose 11,21,22, bem como para revestir superfícies de vidro, papel e pano11,23,24 com dispositivos CFPS. Os protocolos aqui apresentados demonstram dois métodos para incorporar reações CFPS em matrizes de hidrogel em macroescala (i.e., >1 mm), usando agarose como material exemplar. A agarose foi escolhida devido à sua alta capacidade de absorção de água, propriedades autogelificantes controladas e propriedades mecânicas ajustáveis 11,24,25,26. Agarose também suporta CFPS funcional, é mais barato do que muitas outras alternativas de hidrogel, e é biodegradável, tornando-se uma escolha atraente como um sistema modelo experimental. Esses métodos, no entanto, foram previamente demonstrados como apropriados para incorporar CFPS em uma variedade de hidrogéis alternativos11. Considerando a ampla gama de aplicações dos hidrogéis e a funcionalidade da CFPS, os métodos aqui demonstrados podem fornecer uma base a partir da qual os pesquisadores são capazes de desenvolver materiais hidrogéis biologicamente aprimorados adequados aos seus próprios fins.
Em estudos anteriores, sistemas de microgel com faixa de tamanho de 1 μm a 400 μm foram utilizados para realizar CFPS em hidrogéis submersos em tampão de reação 23,27,28,29,30,31. A exigência de submergir hidrogéis dentro de tampões de reação CFPS, no entanto, limita as oportunidades para sua implantação como materiais por direito próprio. Os protocolos aqui apresentados permitem que as reações de CFPS ocorram dentro de hidrogéis sem a necessidade de submergir os géis em tampões de reação. Em segundo lugar, o uso de géis de macroescala (entre 2 mm e 10 mm de tamanho) permite o estudo da interação física entre hidrogéis e expressão gênica livre de células. Por exemplo, com essa técnica, é possível estudar como a matriz de hidrogel afeta as reações de CFPS11 e como as reações de CFPS podem afetar a matriz de hidrogel31. Tamanhos maiores de hidrogéis também permitem o desenvolvimento de novos materiais bioprogramáveis32. Finalmente, ao incorporar reações CFPS em hidrogéis, há também uma redução potencial na necessidade de vasos de reação plástica. Para a implantação de sensores sem células, isso tem vantagens claras sobre dispositivos dependentes de plásticos. Em conjunto, a incorporação de reações CFPS em hidrogéis fornece várias vantagens para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório.
O objetivo geral dos métodos aqui apresentados é permitir a operação de reações CFPS dentro de matrizes de hidrogel. Dois métodos diferentes são demonstrados para incorporar reações de produção de proteínas livres de células em materiais hidrogéis em macroescala (Figura 1). No Método A, componentes CFPS são introduzidos em hidrogéis de agarose liofilizados para formar um sistema ativo. No método B, a agarose fundida é misturada com componentes da reação CFPS para formar um sistema completo de hidrogel CFPS, que é então liofilizado e armazenado até que seja necessário. Estes sistemas podem ser reidratados com um volume de água ou tampão e analito para iniciar a reação.
Este estudo utiliza sistemas baseados em lisado celular de Escherichia coli . Estes são alguns dos sistemas CFPS experimentais mais populares, pois a preparação de lisado celular de E. coli é simples, barata e alcança altos rendimentos proteicos. O lisado celular é complementado com os componentes macromoleculares necessários para realizar a transcrição e tradução, incluindo ribossomos, RNAt, aminoacil-tRNA sintetases e fatores de iniciação, alongamento e terminação. Especificamente, este trabalho demonstra a produção de eGFP e mCherry em hidrogéis de agarose usando lisados celulares de E. coli e monitora a aparência da fluorescência usando um leitor de placas e microscopia confocal. Resultados representativos para o leitor de placas de microtitulação podem ser vistos em Whitfield et al.31, e os dados subjacentes estão disponíveis publicamente33. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes através dos géis é confirmada usando microscopia confocal. Os dois protocolos demonstrados neste trabalho permitem a montagem e armazenamento de dispositivos genéticos baseados em CFPS em matéria com o objetivo final de criar um ambiente físico adequado para a distribuição de circuitos gênicos livres de células de forma a apoiar a implantação em campo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214793B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10752.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Severn Biotech</td>
			<td>30-15-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino Acid Sampler Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BTRABR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J14121.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NG01208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>757551-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD037-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein concentration kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71397-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J23160.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS4323-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MWCO dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3120-9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer</td>
			<td>Christ</td>
			<td>part no. 101521, 101522, 101527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H-X3R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 384 well microtitre plates</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elga Purelab Chorus</td>
			<td>Elga</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP00532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP license</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15353518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photospectrometer (Biophotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>16713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16384738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12893543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Static Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and needles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Lux platereader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>OU-04724-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&#176;c meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1657</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogels

As redes genéticas sintéticas fornecem uma plataforma para cientistas e engenheiros projetarem e construírem novos sistemas com funcionalidade codificada em nível genético. Enquanto o paradigma dominante para a implantação de redes gênicas está dentro de um chassi celular, redes gênicas sintéticas também podem ser implantadas em ambientes livres de células. Aplicações promissoras de redes gênicas livres de células incluem biossensores, já que esses dispositivos foram demonstrados contra alvos bióticos (vírus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abióticos (metais pesados, sulfetos, pesticidas e outros contaminantes orgânicos). Sistemas livres de células são tipicamente implantados na forma líquida dentro de um vaso de reação. Ser capaz de incorporar tais reações em uma matriz física, no entanto, pode facilitar sua aplicação mais ampla em um conjunto mais amplo de ambientes. Para este fim, métodos para incorporar reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em uma variedade de matrizes de hidrogel têm sido desenvolvidos. Uma das principais propriedades dos hidrogéis propícios a este trabalho é a alta capacidade de reconstituição de água dos materiais hidrogéis. Além disso, os hidrogéis possuem características físicas e químicas funcionalmente benéficas. Os hidrogéis podem ser liofilizados para armazenamento e reidratados para uso posterior. Dois protocolos passo-a-passo para a inclusão e ensaio de reações de CFPS em hidrogéis são apresentados. Primeiro, um sistema CFPS pode ser incorporado a um hidrogel via reidratação com um lisado celular. O sistema dentro do hidrogel pode então ser induzido ou expresso constitutivamente para a expressão completa de proteínas através do hidrogel. Em segundo lugar, o lisado celular pode ser introduzido em um hidrogel no ponto de polimerização, e todo o sistema pode ser liofilizado e reidratado em um ponto posterior com uma solução aquosa contendo o indutor para o sistema de expressão codificado dentro do hidrogel. Esses métodos têm o potencial de permitir redes gênicas livres de células que conferem capacidades sensoriais a materiais hidrogéis, com potencial para implantação além do laboratório.

Synthetic biology integrates diverse engineering disciplines to design and engineer biologically based parts, devices, and systems that can perform functions that are not found in nature. Most synthetic biology approaches are still bound to living cells. By contrast, cell-free synthetic biology systems facilitate unprecedented levels of control and freedom in design, enabling increased flexibility and a shortened time for engineering biological systems while eliminating many of the constraints of traditional cell-based gene expression methods1,2,3. CFPS is being used in an increasing number of applications across numerous disciplines, including constructing artificial cells, prototyping genetic circuits, developing biosensors, and producing metabolites4,5,6. CFPS has also been particularly useful for producing recombinant proteins that cannot be readily expressed in living cells, such as aggregation-prone proteins, transmembrane proteins, and toxic proteins6,7,8.
CFPS is typically performed in liquid reactions. This, however, may restrict their deployment in some situations, as any liquid cell-free device must be contained within a reaction vessel. The rationale for the development of the methods presented here was to provide robust protocols for embedding cell-free synthetic biology devices into hydrogels, not as a protein production platform per se but, instead, to allow the use of hydrogels as a physical chassis for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory. The use of hydrogels as CFPS chassis has several advantages. Hydrogels are polymeric materials that, despite a high water content (sometimes in excess of 98%), possess solid properties9,10,11. They have uses as pastes, lubricants, and adhesives and are present in products as diverse as contact lenses, wound dressings, marine adhesive tapes, soil improvers, and baby diapers9,11,12,13,14. Hydrogels are also under active investigation as drug delivery vehicles9,15,16,17. Hydrogels may also be biocompatible, biodegradable, and possess some stimuli responses of their own9,18,19,20. Therefore, the goal here is to create a synergy between molecular biology-derived functionality and materials science. To this end, efforts have been made to integrate cell-free synthetic biology with a range of materials, including collagen, laponite, polyacrylamide, fibrin, PEG-peptide, and agarose11,21,22, as well as to coat surfaces of glass, paper, and cloth11,23,24 with CFPS devices. The protocols presented here demonstrate two methods for embedding CFPS reactions in macro-scale (i.e., &#62;1 mm) hydrogel matrices, using agarose as the exemplar material. Agarose was chosen due to its high water absorption capacity, controlled self-gelling properties, and tuneable mechanical properties11,24,25,26. Agarose also supports functional CFPS, is cheaper than many other hydrogel alternatives, and is biodegradable, making it an attractive choice as an experimental model system. These methods have, however, been previously demonstrated as appropriate for embedding CFPS in a range of alternative hydrogels11. Considering the wide range of applications of hydrogels and the functionality of CFPS, the methods demonstrated here can provide a basis from which researchers are able to develop biologically enhanced hydrogel materials suited to their own ends.
In previous studies, microgel systems with a size range of 1 &#181;m to 400 &#181;m have been used to perform CFPS in hydrogels submerged in reaction buffer23,27,28,29,30,31. The requirement to submerge hydrogels within CFPS reaction buffers, however, limits opportunities for their deployment as materials in their own right. The protocols presented here allow CFPS reactions to occur within hydrogels without the need to submerge the gels in reaction buffers. Second, the use of macroscale gels (between 2 mm and 10 mm in size) allows the study of the physical interaction between hydrogels and cell-free gene expression. For example, with this technique, it is possible to study how the hydrogel matrix affects CFPS reactions11 and how CFPS reactions can impact the hydrogel matrix31. Larger sizes of hydrogels also allow for the development of novel, bio-programmable materials32. Finally, by embedding CFPS reactions into hydrogels, there is also a potential reduction in the requirement for plastic reaction vessels. For the deployment of cell-free sensors, this has clear advantages over devices dependent on plasticware. Taken together, embedding CFPS reactions in hydrogels provides several advantages for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory.
The overall goal of the methods presented here is to allow the operation of CFPS reactions within hydrogel matrices. Two different methods are demonstrated for embedding cell-free protein production reactions in macro-scale hydrogel materials (Figure 1). In Method A, CFPS components are introduced to lyophilized agarose hydrogels to form an active system. In Method B, molten agarose is mixed with CFPS reaction components to form a complete CFPS hydrogel system, which is then lyophilized and stored until needed. These systems can be rehydrated with a volume of water or buffer and analyte to commence the reaction.
This study uses Escherichia coli cell lysate-based systems. These are some of the most popular experimental CFPS systems, as E. coli cell lysate preparation is simple, inexpensive, and achieves high protein yields. The cell lysate is complemented with the macromolecular components needed to perform transcription and translation, including ribosomes, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases, and initiation, elongation, and termination factors. Specifically, this paper demonstrates the production of eGFP and mCherry in agarose hydrogels using E. coli cell lysates and monitors the appearance of fluorescence using a plate reader and confocal microscopy. Representative results for the microtiter plate reader can be seen in Whitfield et al.31, and the underlying data are publicly available33. Further, the expression of fluorescent proteins throughout the gels is confirmed using confocal microscopy. The two protocols demonstrated in this paper allow for the assembly and storage of CFPS-based genetic devices in materia with the ultimate goal of creating a suitable physical environment for the distribution of cell-free gene circuitry in a manner supportive of field deployment.

Autor em destaque: uma nova abordagem para incorporar reações de síntese de proteínas livres de células em hidrogéis 

Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala

We know living systems continuously integrate information from many different sources and that these signals trigger complex and subtle responses. Much of this information processing occurs at the molecular level. We're interested in operating these processes within materials, but without cells.The purpose is to give materials novel functionality. Challenges in this work are primarily associated with the cell-free protein synthesis reaction, rather than working with hydrogel. Cell reaction require high quality cell lysate as well as high quality and purity DNA to function well.This protocol allows researchers to embed molecular biology reactions into a physical biodegradable material that can be taken outside of the laboratory. Also, because the reaction output interacts directly with the material chassis, there is potential for the development of materials with novel sensing and response capabilities. In short-term, we see these methods as providing a novel route to the deployment of cell-free diagnostic devices.This protocol allows a number of devices to be created and spatially organized in a manner that is not possible for liquid reactions. Our future interests are twofold. First, we are interested in expanding the nature of the hydrogels we use to bring more material functionality to the work.Second, we are interested in increasing the complexity and performance of the gene networks we operate in gels, expanding the biological functionality of these systems.

Este protocolo detalha dois métodos para incorporar reações de CFPS em matrizes de hidrogel, com a Figura 1 apresentando uma visão geral esquemática das duas abordagens. Ambos os métodos são passíveis de liofilização e armazenamento a longo prazo. O método A é a metodologia mais utilizada por dois motivos. Primeiro, mostrou-se o método mais aplicável para trabalhar com uma variedade de materiais hidrogéis11. Em segundo lugar, o método A permite o test...

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Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Sabemos que os sistemas vivos integram continuamente informações de muitas fontes diferentes e que esses sinais desencadeiam respostas complexas e sutis. Grande parte desse processamento de informações ocorre em nível molecular. Estamos interessados em operar esses processos dentro de materiais, mas sem células.O objetivo é dar aos materiais uma nova funcionalidade. Os desafios neste trabalho estão primariamente associados à reação de síntese proteica livre de células, ao invés de trabalhar com hidrogel. A reação celular requer lisado celular de alta qualidade, bem como DNA de alta qualidade e pureza para funcionar bem.Esse protocolo permite que os pesquisadores incorporem reações de biologia molecular em um material físico biodegradável que pode ser levado para fora do laboratório. Além disso, como a saída de reação interage diretamente com o chassi do material, há potencial para o desenvolvimento de materiais com novas capacidades de detecção e resposta. Em curto prazo, vemos esses métodos como fornecendo uma nova rota para a implantação de dispositivos de diagnóstico livres de células.Este protocolo permite que uma série de dispositivos sejam criados e organizados espacialmente de uma maneira que não é possível para reações líquidas. Os nossos interesses futuros são duplos. Primeiro, estamos interessados em expandir a natureza dos hidrogéis que usamos para trazer mais funcionalidade material para o trabalho.Em segundo lugar, estamos interessados em aumentar a complexidade e o desempenho das redes gênicas que operamos em géis, expandindo a funcionalidade biológica desses sistemas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

869 visualizações.  Newcastle University. Sabemos que os sistemas vivos integram continuamente informações de muitas fontes diferentes e que esses sinais desencadeiam respostas complexas e sutis. Grande parte desse processamento de informações ocorre em nível molecular. Estamos interessados em operar esses processos dentro de materiais, mas sem células.O objetivo é dar aos materiais uma nova funcionalidade. Os desafios neste trabalho estão primariamente associados à reação de síntese proteica livre de células, ao ...

Vídeo: Autor em destaque: uma nova abordagem para incorporar reações de síntese de proteínas livres de células em hidrogéis 

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Biologia

Cell-Free Protein Synthesis in Rehydrated Lyophilized Hydrogels

To begin, transfer the hydrogels to 1.5 milliliter micro centrifuge tubes, trimming the gels with a scalpel if necessary to make them fit in the wells. In another 1.5 milliliter micro centrifuge tube, combine 10 microliters of the cell-free extract with 25 microliters of two x cell-free protein synthesis buffer and four micrograms of plasmid DNA. Make up to a total volume of 50 microliters with double distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution.Pipette the solution onto the freeze dried hydrogels, and allow the gels to soak in the cell-free protein synthesis system for five to 10 minutes at room temperature. Transfer the gels to a black 384 well microtiter plate using a spatula. Then, transfer the microtiter plate to a plate reader, and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis.

Síntese de Proteínas Livres de Células em Hidrogéis Liofilizados Reidratados

Cell-Free Protein Synthesis in Deployable Hydrogels

In a 1.5 milliliter microcentrifuge tube on ice, combine 10 microliters of the cell-free extract with four micrograms of plasmid DNA and 25 microliters of 2X cell-free protein synthesis buffer. Make up to a total volume of 50 microliters with double-distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution. Weigh 0.75 grams of agarose and add it to 100 milliliters of double-distilled water buffer to prepare 0.75%agarose.Microwave the 0.75%agarose in 30-second bursts at high power and pipette 50 microliters of the molten agarose into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes or into molds of a desired shape. Place the molten agarose on a heat block set to 50 degrees Celsius and allow the agarose to cool but not polymerize. Then, mix the molten agarose with the cell-free protein synthesis solution by pipetting and stirring with the pipette tip.Allow the gels to cool to room temperature and polymerize for approximately two minutes. Transfer the polymerized agarose to 1.5-milliliter microcentrifuge tubes with a spatula and flash freeze in liquid nitrogen. Place the flash-frozen hydrogels into minus 80 degrees Celsius storage for one hour.After that, remove the microcentrifuge tube lids. Cover the tubes with a wax film and pierce the film to allow the moisture to be dried off. Set the temperature of the freeze dryer to minus 20 degrees Celsius and pressure to 0.1 millibars and freeze-dry the cell-free protein synthesis devices for 18 hours or overnight.Rehydrate the freeze-dried devices for 30 minutes with 50 microliters of double-distilled water without excess liquid, and transfer the gels to a black 384-well microtiter plate using a spatula. Finally, place the microtiter plate on a plate reader and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis. The cell-free protein synthesis of eGFP and mCherry in a hydrogel using E.coli cell lysates is shown in this figure.0.75%agarose gels were prepared without DNA template with four micrograms of either eGFP or mCherry template or with four micrograms of both eGFP and mCherry template. An overlay of the two channels is also shown, and the overlay includes the differential interference contrast image. The results confirmed the co-expression of both mCherry and eGFP in agarose.