Os autores gostariam de agradecer o Dr. David Tirrell (Caltech), pelo seu dom tipo de plasmídeo pQE9 AC 10 ATRP 12, o Dr. Tom Muir (Universidade de Princeton), pelo seu dom tipo de plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japão), pelo seu dom tipo de plasmídeo pET30-cuta-Tip1 10, e Dr. Jay Keasling D. (UC Berkley) pelo seu dom tipo de plasmídeo pJD757 13 . Este trabalho foi apoiado em parte pela National Science Foundation CARREIRA, EUA Força Aérea YIP e Norman Hackman Programa Advanced Research.

1. Plasmídeo Construção NOTA: Todos os genes foram amplificados em reações de PCR padrão usando Phusion High-Fidelity DNA polimerase por especificações do fabricante. Os iniciadores utilizados para a clonagem foram descritas anteriormente 9. Todas as construções estão listadas na Tabela 1. <ol><li> Para gerar cuta-NpuN (N, Tabela 1): <ol><li> PCR amplificar genes CUTA e NpuN de plasmídeos pET30-cuta-Tip1 10 e KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados. </li><li> Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma marca de 6xHistidine C-terminal para gerar N (Figura 2A). </li></ol></li><li> Para gerar NpuC-S-cuta (C, Tabela 1): <ol><li> PCR amplificar NpuC, Cuta e S fragmentaçãoT [AG 3 (PEG)] 10 a partir do plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, pET30-cuta-Tip1 10 e pQE9 AC 10 PRTA 12, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados. </li><li> Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma 6xHistidine C-terminal para gerar C (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para gerar NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, Tabela 1): <ol><li> PCR amplificar Cuta usando primers contendo um lig SH3 (PPPALPPKRRR) e um ligante flexível (GGGGS) 2 para gerar fragmento SH3 lig-cuta. </li><li> Substitua o gene Cuta de C com fragmento SH3 lig-cuta. </li></ol></li><li> Para gerar SH3-GFP (Tabela 1): <ol><li> Amplificar o gene a partir do plasmídeo SH3 pJD757 13 usando oiniciadores apropriados. </li><li> Fundir este fragmento com o gene GFP e inseri-la no vector pET26b entre o promotor T7 (Figura 2C) e uma etiqueta de 6xHistidine C-terminal. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression <ol><li> Transformar 50 ul de quimicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) com o plasmídeo de expressão apropriado. </li><li> Após a transformação, serialmente diluídas estas células, e placa-los em meio Luria-Bertani (LB) / placas de agar contendo 50 ug / ml de canamicina. </li><li> Incubar as placas que contêm células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas. </li><li> Após a incubação, pegar uma placa que contém 50-100 colônias e ressuspender todas as colônias em 5 ml de caldo LB. </li><li> Transferência de suspensão de 1 L de caldo LB contendo canamicina (50 ug / ml) e as células crescer a 37 ° C com agitação a 250 rpm. Monitorar a absorvância a 600 nm (OD 600). Crescer cultura até OD 600 ~ 0,8. <ol><li> Para C e C-SH3 lig, induzir a expressão da proteína por adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura (1 mM concentração final) e incubar a cultura a 37 ° C durante 4 horas, agitando a 250 rpm. </li><li> Para N e SH3-GFP, arrefecer a cultura a ~ 18 ° C por imersão do frasco de cultura em um banho de água gelada durante ~ 5 min. Induzir a expressão da proteína por adição de IPTG à cultura (concentração final 1 mM) e incuba-se a cultura a 18 ° C durante 14-18 h, agitando a 250 rpm. </li></ol></li><li> Após expressão de proteína, centrifugar a cultura a 6.000 x g durante 20 min a 4 ° C para recolher o sedimento. Pellet celular armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Purificação de Proteínas <ol><li> Purificação de N (condições de desnaturação) <ol><li> Os sedimentos de células ressuspender em tampão A (Tabela 2) em 10 ml / g de sedimento húmido. </li><li> Immerso e a suspensão da pelota em um banho de gelo-água e romper as células por ultra-sons (10 Amp, com um segundo pulso e 6 seg pausa durante 1 min). </li><li> Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em tampão de DA (contendo 8 M de ureia) e centrifugar a suspensão a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Passe o sobrenadante através de uma coluna de 5 ml de ácido Ni-nitrilotriacético (NTA) previamente equilibrada com DA buffer. </li><li> Lavar coluna com 30 ml de tampão DA suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão DA suplementado com 150 mM de imidazole. </li><li> Reduzir a concentração de ureia na amostra de proteína para &lt;1 mM, por qualquer um dos métodos a seguir indicados no 3.1.7.1 ou 3.1.7.2: <ol><li> Dializar proteína em tampão de DPBS (Tabela 2), a 4 ° C durante a noite utilizando tubos com &lt;20 kDa de corte. </li><li> Centrífuga proteína purificada em um 30 &amp; #160; kDa ultra-filtração coluna de centrifugação a 2,800 xg, 4 ° C até que o volume é inferior a 1 ml. Adicionar 14 ml de tampão de DPBS à coluna para diluir a amostra de proteína. Repita a centrifugação / diluição passos mais três vezes. </li></ol></li><li> Após troca de tampão, adicionar o ditiotreitol (DTT) para a proteína purificada (final 2 mM) e concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml por centrifugação através de uma ultra-filtração coluna de centrifugação de 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C. </li><li> Alíquota da proteína concentrada e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Purificação de C e C-SH3 lig (condição nativa) <ol><li> Os sedimentos de células ressuspender em tampão B (pH 6,0) (Tabela 2) suplementado com 1x cocktail inibidor de protease a 10 ml / g de sedimento húmido. Utilize tampão acidico para minimizar a degradação proteolítica da proteína alvo. </li><li> Interromper a suspensão de células por ultra-sons como descrito em 3.1.2. Centrifugar as lisComeram a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter-se o sobrenadante. </li><li> Passar o lisado solúvel por meio de uma de 5 ml de coluna de Ni-NTA, previamente equilibrada com tampão B. </li><li> Lavar a coluna com tampão B complementado com imidazole 45 mM, e elui-se a proteína alvo em 20 ml de tampão B complementado com imidazole 150 mM. </li><li> Para C, pule para o passo 3.2.6. Para C-SH3 lig, realizar uma etapa de purificação de troca iônica adicional para remover proteína parcialmente degradada como dado em passos 3.2.5.1 para 3.2.5.3 <ol><li> Reduzir a concentração de NaCl no C-SH3 lig a &lt;1 mM, seguindo o procedimento descrito em 3.1.7. </li><li> Carregar a proteína alvo em um permutador de aniões 5 ml de contas de agarose a coluna de matriz, previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,0). </li><li> Proteína alvo eluem a partir da coluna, executando um gradiente a partir de uma solução contendo 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer a uma solução contendo o mesmo tampão suplementado com 1 M de NaCl. Retirar amostras durante a eluição da proteína e amostras de piscina com a pureza mais elevada com base em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS, como descrito em 3.1.7. </li><li> Adicionar DTT para a proteína purificada (concentração final 2 mM) e concentra-se a proteína a ~ 100 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8. Alíquotas e armazenamento de concentrado de proteína de -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Purificação de SH3-GFP <ol><li> Os sedimentos de células Ressuspender utilizando tampão A, a 10 ml / g de sedimento húmido. </li><li> Disrupt suspensão pellet por sonicação como descrito no ponto 3.1.2. </li><li> Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante. </li><li> Passa-se o sobrenadante (lisado solúvel) por meio de um 5 ml de coluna de Ni-NTA equilibrada previamente comTampão A. </li><li> Lavar coluna com 30 ml de tampão A suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão A suplementado com 150 mM de imidazole. </li><li> Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no 3.1.7 e concentrar a proteína de ~ 150 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8. </li><li> Alíquotas e armazenamento de proteína purificada a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> A análise de SDS-PAGE de amostras purificadas contendo CUTA <ol><li> Dilui-se cada proteína purificada em água duplamente destilada para reduzir a concentração de NaCl para ~ 1 mM. A esta concentração de NaCl, a maioria das proteínas CUTA trímeros executado como monómeros sobre os géis de SDS-PAGE. </li><li> Misturar as amostras com tampão de amostra 2x SDS (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v de bromo-fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), incubados a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Carregue o sampios num gel de SDS-PAGE a 12%. Realizar eletroforese a uma tensão constante de 200 V para ~ 50 min. </li><li> Observar proteína nos géis por coloração com azul brilhante de Coomassie R250 a seguir os protocolos padrão (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 4. Formação Hidrogel NOTA: os hidrogéis de amostras efectuadas neste estudo contêm 1,6 mM de cada bloco de construção hidrogel salvo indicação em contrário. Esta concentração de proteína produz um hidrogel macia e estável. ATENÇÃO: A azida de sódio (NaN 3) é adicionado ao hidrogel para uma concentração final de 0,5% w / v para evitar a contaminação bacteriana. NaN 3 é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado, como indicado na Ficha de Segurança. <ol><li> Calcular o volume de cada uma das proteínas concentradas necessários para alcançar uma concentração final de 1,6 mM em um hidrogel 100 ul de amostra. Por exemplo: A concentração de N:100 mg / mL Peso molecular de N: 26,3 kDa (ver Tabela 1) Concentração 100 l desejado:: volume desejado de 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Para tornar um hidrogel 100 ul (1,6 mM), mistura C (x ul, o volume calculado de acordo com 4.1) com 5% de NaN 3 (10 mL), DTT 100 mM (5 mL) e N (y ul, o volume calculado de acordo com a 4,1) dentro de um frasco de vidro de 2 ml. </li><li> Adicionar tampão de DPBS ((85 - x - y) ul) para o frasco de forma a alcançar um volume final de 100 ul, e misturar todos os componentes manualmente através de um movimento rotativo utilizando uma ponta de pipeta. Nota: A solução torna-se muito viscosa ao ser misturado. </li><li> Centrifugar a mistura durante 2 min a 8000 xg para remover as bolhas de ar. </li><li> Incubar a mistura de quartotemperatura durante a noite para permitir que a reacção de splicing trans intein para atingir a conclusão. Confirme formação hidrogel girando tubo de cabeça para baixo. As proteínas não fluirá se um hidrogel é formado. </li><li> Estimar o rendimento intein trans-splicing, verificando amostras (0,5 ul cada) recolhidos antes do passo 4.2 e após a etapa 4.5 em um gel de SDS-PAGE, como descrito no ponto 3.4 (Figura 1C). </li></ol> 5. Imobilização de GFP via proteína de ancoragem (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interação <ol><li> Para fazer com que um 50 ul funcionalizada-GFP hidrogel (1,2 mM), combinar C-SH3 de Nata (x ul, calculado de acordo com 4.1) e SH3-GFP (y ul, calculado de acordo com 4.1) em razão molar de 1:1 em um 1,7 ml tubo de microcentrífuga e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionam-se 5% de NaN3 (5 mL), DTT 100 mM (2,5 mL), (42,5 - x - &lt;em&gt; y) DPBS ul para o mesmo tubo. Adiciona-se N (y ul, calculado de acordo com a 4.1) para se atingir uma proporção de 1:1 molar de N e C-SH3 lig. Misturar a amostra usando uma ponteira por um movimento giratório. </li><li> Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante a noite no escuro. Um hidrogel encapsulando formas SH3-GFP durante a incubação. </li></ol> 6. Uso de Hidrogel 1,6 mM como um andaime para Imobilização Reação enzimática em solvente orgânico <ol><li> Use o HRP como uma enzima modelo. Prepara-se uma solução estoque de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) em DPBS. </li><li> Para tornar um hidrogel 30 ul (1,6 mM) aprisionamento HRP, combinam C (x ul, calculado de acordo com 4.1) com HRP (2 mL), 5% de NaN 3 (3 mL) e DTT (1,5 mL de 100 mM) no interior de um 1,7 ml tubo de centrifugação. </li><li> Adiciona-se N (y &lt;/ Em&gt; il, calculados de acordo com 4.1) e DPBS (23,5 - x - y) mL. Misture com a ponta da pipeta com um movimento giratório. </li><li> Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar à temperatura ambiente durante a noite. ATENÇÃO: os regentes utilizados para o ensaio seguinte atividade são altamente tóxicos. Use as recomendações de segurança específicas das respectivas fichas de segurança. </li><li> Por reacção enzimática, submergir o hidrogel em 1 ml de cocktail de reacção contendo N, diamina de N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) em n-heptano 14. Interromper manualmente o gel utilizando uma ponteira para aumentar a área da superfície de contato do hidrogel e do solvente. </li><li> Detectar produto HRP, um corante do tipo indofenol, por medição da absorvância óptica de amostras tomadas a diferentes tempos a 546 nm num leitor de placas (Figura 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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Não existem interesses financeiros concorrentes.

Neste trabalho, nós demonstramos a síntese de uma proteína de hidrogel intein mediada altamente estável. O uso de uma divisão permite intein o hidrogel ser condicionalmente formada em resposta à mistura de dois componentes em fase líquida. Especificamente, a divisão intein covalentemente liga dois blocos em fase líquida através de uma reação de trans-splicing, produzindo uma unidade polipeptídeo ladeado por reticulação unidades que, por sua vez auto monta em um hidrogel. A formação induzida por...

Os hidrogéis feitos inteiramente de proteínas carregam o potencial para avançar significativamente campos tão diversos como a engenharia de tecidos, distribuição de medicamentos e biofabrication 1. Eles oferecem vantagens sobre os hidrogéis de polímero sintético tradicionais, incluindo biocompatibilidade e o potencial para apoiar de forma não invasiva a incorporação de proteínas globulares bioactivos. Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um novo hidrogel de proteína formada por meio de uma resposta mediada intein dividida proteína reacção de splicing trans e sua aplicação como suporte de imobilização de proteína (Figura 1). Os blocos de construção para esta hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteína, compreendendo cada fragmento o N-ou C-terminal de uma divisão intein (IN e IC) e uma subunidade de uma proteína multimérica reticulador. O DNAE intein de Nostoc punctiforme (NPU) foi usada como o grupo intein 2,3 e uma pequena proteína trimérica (12 kDa) a partir de CUTA Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; foi usado como o agente de ligação cruzada de proteínas a 4,5. Diferentes agentes de reticulação são unidas por meio de reacção de splicing trans intein catalisada, levando à formação de uma rede de proteínas altamente reticulado (hidrogel). NPU intein foi escolhido por causa de sua cinética de reação rápida (t 1/2 = 63 seg) e alto rendimento trans-splicing (perto de 80%) 2,3. A proteína CUTA foi escolhido como o agente de ligação cruzada, devido à sua elevada estabilidade. Trímeros CUTA têm uma temperatura de desnaturação de perto de 150 ° C e manter a estrutura quaternária trimérico em soluções contendo tanto como 5 M de cloridrato de guanidina 4,6. Desde subunidade troca entre os diferentes agentes de reticulação é um dos principais contribuintes da superfície hidrogel físico erosão 7, a interação entre subunidade muito forte em Cuta deve desencorajar tais trocas de subunidades, levando a um hidrogel mais estável. Um desses blocos de construção também contém um peptídeo S-fragmento altamente hidrofílico como o meio-bloco para facilitar a águaretenção 8. A mistura dos dois blocos de construção de hidrogel inicia uma reacção de splicing trans entre a IN e IC intein fragmentos, gerando uma corrente mais polipeptídeo com agentes de ligação cruzada em ambos os terminais. Reticuladores de várias de tais unidades moleculares interagir uns com os outros, formando uma rede de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Um específico &quot;encaixe estação péptido&quot; (DSP) é incorporado um dos blocos de construção de hidrogel a fim de facilitar a imobilização estável de uma &quot;proteína de ancoragem&quot; (DP) marcado com proteína alvo no hidrogel. O uso de uma divisão intein para mediar a montagem de hidrogel não só fornece flexibilidade adicional para a síntese de proteína de hidrogel, mas também permite alta densidade, carga uniforme da proteína alvo ao longo de todo o hidrogel, tal como as proteínas alvo são carregados antes da formação do hidrogel. O hidrogel de proteínas mediada por intein é altamente stable em solução aquosa, com pouco ou nenhuma erosão detectável após 3 meses à temperatura ambiente. A estabilidade é mantida numa vasta gama de valores de pH (6-10) e de temperaturas (4-50 ° C), e o hidrogel é também compatível com solventes orgânicos. Este hidrogel é utilizado para a imobilização das duas proteínas globulares: a proteína fluorescente verde (GFP) e a peroxidase de rábano (HRP). Hidrogel aprisionando a última proteína é usada para executar biocatálise em um solvente orgânico.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

Apresentamos a síntese de uma proteína de hidrogel altamente estável mediada por um catalisado-intein dividida proteína reacção de splicing trans. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. Uma bobina aleatório altamente hidrofílico é inserida em um dos copolímeros em bloco de retenção de água. A mistura dos dois copolímeros em bloco a proteína desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de polipeptídeo com agentes de reticulação em ambas as extremidades que rapidamente auto-monta em um hidrogel. Este hidrogel é muito estável tanto em condições ácidas e básicas, a temperaturas até 50 ° C, e em solventes orgânicos. O hidrogel rapidamente reformas após ruptura induzida por cisalhamento. Incorporação de um &quot;encaixe estação peptídeo&quot; para o bloco de construção de hidrogel permite incorporação conveniente de &quot;proteína de ancoragem&quot;, marcado proteínas-alvo.O hidrogel é compatível com o meio de crescimento de cultura de tecidos, suporta a difusão de moléculas de 20 kDa, e permite a imobilização de proteínas globulares bioactivos. A aplicação do hidrogel proteína intein-mediada como um biocatalisador compatível com solvente orgânico foi demonstrada por encapsular a enzima peroxidase de rábano silvestre e corroborar a sua actividade.

Um esquema para a formação do hidrogel de proteína intein mediada é apresentado na Figura 1A. Os blocos de construção de hidrogel são os copolímeros de proteína cuta-NpuN (N) e NpuC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabela 1). NpuN / C são os N-/C-fragments do DNAE dividir naturalmente intein de Nostoc punctiforme (NPU). Cuta é uma proteína trimérica estável de Pyrococcus horikoshii 4,5. Mistura de purificada N e C, na presença do agente redutor DTT induz a forma...

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e temperatura estáveis, compatíveis com solventes orgânicos, e facilmente incorpora proteínas globulares funcionais.

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K visualizações.  Texas A&M University, College Station.  Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta par...

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Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Bioengenharia

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Um Supramolecular hidrogel injetável e carregado com a droga para a injeção local por cateter no coração de porco

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

Um aditivo fabricação técnica para a preparação fácil e rápida de Micromachines baseada em hidrogel com componentes magneticamente responsivos

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D impresso celulose porosa nanocompósitos Hydrogel andaimes

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

Uma plataforma de tecnologia de código aberto para fabricar modelos de cultura 3D à base de hidrogel de forma automatizada e padronizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.