Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82122048; 82003773; 82203380) e pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2023A1515011416).

Tecidos biopsiados por humanos foram obtidos do respectivo paciente no Hospital e Instituto de Câncer Afiliado da Universidade de Medicina de Guangzhou, e consentimento informado foi obtido dos pacientes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Estabelecimento de organoides de CHC derivados do paciente a partir de amostras cirúrgicas
NOTA: O estabelecimento dos organoides de CHC engloba várias etapas, nomeadamente dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreserva e ressuscitação. O processo de dissociação do tecido requer uma duração de 2 h, enquanto a semeadura de organoides em uma placa leva aproximadamente 40 min. Em seguida, a geração inicial de organoides de CHC passa por um período de cultura de 10-14 dias usando meio de isolamento de CHC. Uma vez alcançada uma densidade satisfatória, são conduzidas passagens organoides, o que requer 1 h. Culturas subsequentes dos organoides são então mantidas usando meio de expansão de CHC por 7-10 dias, que podem variar dependendo da taxa de crescimento e condição dos organoides.
<ol><li>Dissociação tecidual<ol><li>Preparação de suprimentos e materiais<ol><li>Coletar 1-2 cm3 de tecido de CHC de pacientes que não receberam nenhum tratamento local ou sistêmico prévio antes da operação. Após a ressecção cirúrgica, manter o tecido a 4 °C em solução de preservação tecidual (Tabela 1) até o processamento. NOTA: Amostras de tecido fresco de alta qualidade são essenciais para o estabelecimento bem-sucedido de organoides. É importante processar as amostras prontamente, idealmente dentro de 1-4 h após a ressecção cirúrgica para manter a viabilidade tecidual. Realizar todos os procedimentos subsequentes em ambiente asséptico utilizando materiais estéreis e reagentes.</li>
			<li>Pré-aqueça placas de cultura de células de superfície de fixação ultrabaixa (24 poços) por 1 h em uma incubadora a 37 °C. Descongelar o extrato congelado da membrana basal (BME) durante a noite a 4 °C até pouco antes do uso. OBS: Para garantir o descongelamento completo da EMB, esta deve ser colocada no gelo por pelo menos 3 h. O derretimento completo da EMB é essencial para o sucesso da cultura de organoides nas etapas subsequentes.</li>
			<li>Antes da utilização, certifique-se de que a solução de digestão (quadro 1) é aquecida a uma temperatura de 37 °C. NOTA: Prepare a solução de digestão na hora em um ambiente asséptico e utilize-a prontamente.</li>
		</ol></li>
		<li>Fluxo de processamento organizacional<ol><li>Em uma cabine de fluxo laminar, cortar o tecido tumoral em pequenos pedaços (0,5-1 mm3) usando tesoura cirúrgica em uma placa de Petri. Transferir o tecido clipado para um tubo cônico de 15 mL e adicionar 5-10 mL de meio basal (Tabela 1). NOTA: O meio basal (Tabela 1) pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.</li>
			<li>Use uma pipeta barotrópica para lavar o máximo de sangue possível e deixe-o repousar por 1-2 minutos para remover parte do sobrenadante, incluindo quaisquer células sanguíneas e coágulos de gordura flutuantes. Repita este procedimento duas vezes.</li>
			<li>Centrifugar a mistura a 300 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar 5 mL da solução de digestão pré-aquecida (Tabela 1) ao tecido aparado.</li>
			<li>Girar o tubo a 37 °C para digestão.</li>
			<li>Após 30 minutos de digestão inicial, procure pequenos aglomerados de células ao microscópio. Verifique a cada 5-10 minutos para evitar a digestão excessiva. NOTA: O tempo necessário para a digestão do tecido dependerá do tamanho e do tipo de tecido. A digestão dos tecidos não deve exceder 90 min. O tecido superdigerido aparecerá sob o microscópio como uma grande folha de células individuais. O nível adequado de digestão é indicado pelo fato de que a maioria deles são cachos de células e têm uma aparência semelhante à uva.</li>
			<li>Interromper a digestão adicionando meio basal frio (Tabela 1) e filtrar em um novo tubo de 50 mL com um filtro de células de 100 μm. Adicionar meio basal frio a um volume de 50 mL.</li>
			<li>Centrifugar as células a 2 × g durante 10 min a 8 °C. Retirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet adicionando mais 50 mL de meio basal gelado (Tabela 1). Repita esta etapa duas vezes. NOTA: A centrifugação de baixa velocidade é usada para permitir que pequenos aglomerados de células se estabeleçam, enquanto as células sanguíneas e os detritos celulares ainda estão suspensos no sobrenadante; O processo é repetido várias vezes para obter uma massa celular de tecido relativamente pura.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Revestimento organoide<ol><li>Após a segunda lavagem, remova o máximo possível do sobrenadante e ressuspenda o número desejado de células (1.000-5.000 células por poço de uma placa de 24 poços) na EMB apropriada para plaqueamento. NOTA: Mantenha sempre o EMB a 4 °C antes da utilização.</li>
		<li>Adicione BME e suspenda clusters de células pequenas no Advanced DMEM/F-12 adicionando BME e pipetando suavemente para cima e para baixo até que os agregados celulares sejam completamente suspensos. Controlar a concentração do EMB entre 30% e 50%.</li>
		<li>Sementes de 50 μL de gotículas de BME misturadas com aglomerados celulares no centro de placas de cultura de 24 poços. OBS: Na medida do possível, não deixe as gotículas se espalharem para a parede lateral da placa do poço. A parede lateral da placa de baixa adsorção não está em um estado de baixa adsorção, e o contato entre as gotículas e a parede lateral levará à adesão, o que não é propício para a incubação subsequente.</li>
		<li>Deixe as placas com as gotículas adicionadas solidificarem a 37 °C por 20 min. Ao final da incubação, adicionar 500 μL de meio pré-aquecido (Tabela 1) a cada poço e incubar em incubadora celular a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura de organoides<ol><li>Atualizar o meio de cultura (Tabela 1) uma vez a cada 2-3 dias. No início do cultivo, cultivar os organoides do CHC em meio de isolamento de CHC (Tabela 1) por 2 semanas.</li>
		<li>Após 2 semanas de incubação com meio de isolamento de CHC, substituir o meio por meio de expansão organoide HCC (Tabela 1) (armazenado a 4 °C por até 2 semanas).</li>
		<li>Refrescar o meio de cultura uma vez a cada 3 dias.</li>
		<li>Após 7-10 dias de cultivo com meio de expansão de CHC, quando o organoide tiver atingido a densidade ou tamanho apropriado, iniciar intervenções experimentais ou passar ou liofilizar os organoides conforme necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaging organoide<ol><li>Preparação de suprimentos e materiais<ol><li>Pré-aqueça placas de cultura de células de superfície de fixação ultrabaixa (24 poços) por 1 h em uma incubadora a 37 °C. Descongelar BME congelado durante a noite a 4 °C até pouco antes da utilização.</li>
			<li>Pré-aquecer solução de colheita organoide e substituto de tripsina a 37 °C por 30 min.</li>
		</ol></li>
		<li>processo de passagem<ol><li>Após a remoção do meio de cultura da placa do poço, transferir a suspensão organoide para um tubo de 15 mL.</li>
			<li>Adicionar solução de colheita de organoides de acordo com a quantidade de BME (500 μL de solução de colheita de organoides por 50 μL de BME) raspando e pipetando para cima e para baixo usando uma pistola de pipeta de 1.000 μL. NOTA: Evite bolhas de ar durante todo o processo para evitar a perda de organoides, pois a presença de bolhas de ar indica maior pressão de pipetagem.</li>
			<li>Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Aspirar suavemente a EMB com uma pipeta de 1.000 μL e observar se a EMB está completamente dissolvida. Observe a cada 10 min até que um aglomerado de células organoides claro seja observado, em seguida, centrifugar a 400 × g por 5 min à temperatura ambiente e remover o máximo possível do sobrenadante. NOTA: Nesta fase, o organoide pode ser congelado e preservado.</li>
			<li>Para digestão enzimática de organoides, adicionar 1-5 mL do substituto de tripsina (de acordo com o número de organoides) e incubar a 37 °C por 2 min. Observar ao microscópio o grau de digestão enzimática para determinar se os organoides se dissociam em pequenos aglomerados de 2-10 células; Caso contrário, continue a digestão enzimática. NOTA: A superdigestão resultará na lise de aglomerados de células organoides em células únicas, diminuindo sua viabilidade e prolongando o tempo de cultura subsequente.</li>
			<li>Adicionar o volume adequado de meio basal frio (Tabela 1) para interromper a digestão.</li>
			<li>Centrifugar os organoides a 400 × g durante 5 min a 8 °C; Remova o sobrenadante tanto quanto possível.</li>
			<li>Ressuspender o número desejado de organoides (1.000-5.000 organoides por poço de uma placa de 24 poços) na matriz apropriada para plaqueamento. Siga os mesmos passos da secção 1.2. NOTA: A densidade de revestimento deve ser otimizada de acordo com a taxa de crescimento e tamanho dos organoides.</li>
			<li>Passe os organoides a cada 10 dias na proporção de 1:3 ou 1:4, dependendo da densidade de crescimento organoidal.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Criopreservação e ressuscitação organoide<ol><li>Criopreservação de organoides<ol><li>Preparar tubos de liofilização, cada tubo confluente com dois poços de uma placa de 24 poços contendo organoides.</li>
			<li>Siga os passos 1.4.2.1 a 1.4.2.4 para a passagem de organoides para obter organoides sem EMB e ressuspenda suavemente os organoides adicionando 500 μL/poço de solução de liofilização organoide a uma placa de 24 poços. NOTA: Dependendo do estado de crescimento e tamanho dos organoides, recomenda-se criopreservar os organoides em cultura até a terceira geração.</li>
			<li>Transfira a suspensão para tubos de liofilização e coloque-a numa caixa de arrefecimento gradiente a -80 °C. Após o resfriamento do gradiente a -80 °C por pelo menos 24 h, transfira os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.</li>
		</ol></li>
		<li>Ressuscitação de organoides<ol><li>Incubar tubos liofilizados em banho-maria a 37 °C e interromper a incubação quando restar apenas um pequeno bloco de gelo.</li>
			<li>Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 8 °C para remover completamente o sobrenadante.</li>
			<li>Siga as seções 1.2 e 1.3 para operações subsequentes.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Otimizando a formação de organoides de HCC para identificação de alvos e desenvolvimento de medicamentos

<ol>
	<li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li><li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma.">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li><li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma:+trends,+risk,+prevention+and+management.">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li><li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma.">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).</li><li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation:+What+the+future+holds.">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li><li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies.">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets.">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li><li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate.">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).</li><li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma.">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma.">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36 (2022).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Um benefício notável dos modelos organoides derivados do paciente reside em sua capacidade de replicar fielmente as características biológicas dos tumores, abrangendo a estrutura do tecido e a paisagem genômica. Esses modelos demonstram um notável nível de acurácia e refletem efetivamente a heterogeneidade e a progressão dos tumores, mesmo durante longos períodos decultivo6,8,9. Através da utilização deste refinado ...

O carcinoma hepatocelular (CHC), um tumor prevalente e extensamentediverso1, tem recebido considerável atenção na comunidade médica. A presença de plasticidade de linhagem e heterogeneidade substancial no CHC sugere que células tumorais originadas de vários pacientes e mesmo lesões distintas dentro de um mesmo paciente podem manifestar características moleculares e fenotípicas diferentes, apresentando obstáculos formidáveis no avanço de abordagens terapêuticas inovadoras2,3,4,5. Consequentemente, é imperiosa a necessidade de maior compreensão dos atributos biológicos e mecanismos de resistência às drogas no CHC para subsidiar a formulação de estratégias de tratamento mais eficazes.
Nas últimas décadas, pesquisadores têm dedicado seus esforços ao desenvolvimento de modelos in vitro com a finalidade de estudar o CHC 3,4. Apesar de alguns avanços, as limitações persistem. Esses modelos englobam uma variedade de técnicas, como a utilização de linhagens celulares, células primárias e xenoenxertos derivados do paciente (PDX). As linhagens celulares servem como modelos in vitro para cultura a longo prazo de células tumorais obtidas de pacientes com CHC, oferecendo os benefícios de conveniência e fácil expansão. Os modelos celulares primários envolvem o isolamento direto e o cultivo de células tumorais primárias de tecidos tumorais dos pacientes, fornecendo assim uma representação de características biológicas que se assemelham muito às dos próprios pacientes. Os modelos PDX envolvem o transplante de tecidos tumorais de pacientes em camundongos, com o objetivo de simular mais fielmente o crescimento e a resposta tumoral. Esses modelos têm sido fundamentais na pesquisa do CHC, mas possuem certas limitações, incluindo a heterogeneidade das linhagens celulares e a incapacidade de replicar totalmente as condições in vivo. Além disso, o cultivo in vitro prolongado pode resultar na deterioração das características e funcionalidades originais das células, colocando desafios na representação precisa das propriedades biológicas do CHC. Além disso, a utilização de modelos PDX é demorada e dispendiosa3.
Para abordar essas limitações e replicar com mais precisão os atributos fisiológicos do CHC, a utilização da tecnologia organoide tem sido introduzida como uma plataforma de pesquisa promissora capaz de superar restrições anteriores. Os organoides, que são modelos celulares tridimensionais cultivados in vitro, têm a capacidade de replicar a estrutura e a funcionalidade de órgãos reais. No entanto, no contexto do CHC, existem alguns desafios no estabelecimento de modelos organoides. Esses desafios incluem descrições insuficientemente detalhadas dos procedimentos de construção de organoides de CHC, falta de protocolos abrangentes para todo o processo de construção de organoides de CHC e o tamanho tipicamente pequeno de organoides cultivados 6,7,8. À luz das dimensões tipicamente limitadas dos organoides cultivados, nós nos esforçamos para enfrentar esses desafios através do desenvolvimento de um protocolo abrangente abrangendo a totalidade da construção de organoides de CHC6. Esse protocolo engloba dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passaging, criopreservação e ressuscitação. Otimizando as etapas do procedimento e refinando a composição do meio de cultura, estabelecemos com sucesso modelos organoides de CHC capazes de crescimento sustentado e passaging a longo prazo 6,8. Nas seções subsequentes, um relato abrangente dos meandros operacionais e fatores pertinentes envolvidos na construção de organoides de CHC será apresentado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-gastrin I human</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYMCT150LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301 (TGF&#946; inhibitor)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (503), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (503), serum-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-03P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer size 100 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Ultra-Low</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D SYSTEMS</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Organoid harvesting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24010043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (1003)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A0737-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spodin1-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical specimen of tumor removed from HCC patients</td>
			<td>Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Trypsin substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3a-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor altamente prevalente e letal em todo o mundo e sua descoberta tardia e a falta de agentes terapêuticos específicos eficazes requerem mais pesquisas sobre sua patogênese e tratamento. Os organoides, um novo modelo que se assemelha muito ao tecido tumoral nativo e pode ser cultivado in vitro, têm despertado interesse significativo nos últimos anos, com numerosos relatos sobre o desenvolvimento de modelos organoides para câncer de fígado. Neste estudo, otimizamos com sucesso o procedimento e estabelecemos um protocolo de cultura que permite a formação de organoides de CHC de maior tamanho com condições estáveis de passagem e cultura. Descrevemos de forma abrangente cada etapa do procedimento, cobrindo todo o processo de dissociação tecidual do CHC, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreservação e ressuscitação, e fornecemos precauções detalhadas neste artigo. Esses organoides exibem similaridade genética com os tecidos originais do CHC e podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a identificação de potenciais alvos terapêuticos para tumores e subsequente desenvolvimento de drogas.

Hepatocellular carcinoma (HCC), a prevalent and extensively diverse tumor1, has garnered considerable attention within the medical community. The presence of lineage plasticity and substantial heterogeneity in HCC suggests that tumor cells originating from various patients and even distinct lesions within the same patient may manifest dissimilar molecular and phenotypic traits, thereby presenting formidable obstacles in the advancement of innovative therapeutic approaches2,3,4,5. Consequently, there is an imperative need for enhanced comprehension of the biological attributes and mechanisms of drug resistance in HCC to inform the formulation of more efficacious treatment strategies.
In recent decades, researchers have dedicated their efforts to the development of in vitro models for the purpose of studying HCC3,4. Despite some advancements, limitations persist. These models encompass a range of techniques, such as the utilization of cell lines, primary cells, and patient-derived xenografts (PDX). Cell lines serve as in vitro models for long-term culture of tumor cells obtained from HCC patients, offering the benefits of convenience and facile expansion. Primary cell models involve direct isolation and culture of primary tumor cells from patient tumor tissues, thereby providing a representation of biological characteristics that closely resemble those of the patients themselves. PDX models entail the transplantation of patient tumor tissues into mice, with the aim of more faithfully simulating tumor growth and response. These models have been instrumental in HCC research, yet they possess certain limitations, including the heterogeneity of cell lines and the inability to fully replicate in vivo conditions. Furthermore, prolonged in vitro cultivation may result in the deterioration of the cells&#39; original characteristics and functionalities, posing challenges in accurately representing the biological properties of HCC. Additionally, the utilization of PDX models is both time-consuming and costly3.
To address these limitations and more accurately replicate the physiological attributes of HCC, the utilization of organoid technology has been introduced as a promising research platform capable of surpassing previous constraints. Organoids, which are three-dimensional cell models cultured in vitro, have the ability to replicate the structure and functionality of actual organs. However, in the context of HCC, there exist certain challenges in establishing organoid models. These challenges include insufficiently detailed descriptions of HCC organoid construction procedures, a lack of comprehensive protocols for the entire process of HCC organoid construction, and the typically small size of cultured organoids6,7,8. In light of the typically limited dimensions of cultured organoids, we endeavored to tackle these challenges through the development of a comprehensive protocol encompassing the entirety of HCC organoid construction6. This protocol encompasses tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation. By optimizing the procedural steps and refining the composition of the culture medium, we have successfully established HCC organoid models capable of sustained growth and long-term passaging6,8. In the subsequent sections, a comprehensive account of the operational intricacies and pertinent factors involved in the construction of HCC organoids will be presented.

Autor em destaque: Investigando a patogênese do câncer de fígado usando organoides derivados de pacientes 

Desenvolvimento e Otimização de um Modelo Organoide Derivado de Pacientes com Carcinoma Hepatocelular Humano para Identificação de Alvos Potenciais e Descoberta de Drogas

Our lab aims to investigate the molecular pathogenesis of liver cancer and identify novel therapeutic targets for drug development. We would like to answer how cancer initiates, metastasis, and progress to drug tolerance utilizing novel disease models such as patient derived organoids. The current experimental challenges are in two aspects.First, there is a lack of complete set of protocols for constructing hepatocellular carcinoma organoids for the whole process. Second, the size of cultured HCC organoids is too small for subsequent experimental processing. In this protocol, we provide the details of the optimized organoids culture and subsequent transfer and freezing procedures, as well as the precautions to be taken during all the procedures.We optimized the composition of the organoid medium for organoids with close to the original tissue characteristics. We may monitor the tumor evolution using the patient-derived organoids and try to identify novel molecular and therapeutic targets for HCC treatment.

Ao implementar o procedimento supracitado, a emergência de esferoides organoides do CHC é tipicamente observável em um período de 3 dias (Figura 1). A Figura 1A,B mostra o organoide estabelecido do CHC, que prontamente desenvolve esferoides compactos caracterizados por bordas arredondadas e citosol permeável no dia inicial de estabelecimento. Durante o crescimento dos organoides HCC, o uso de diferentes concentrações de BME teve diferente...

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Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

Nosso laboratório tem como objetivo investigar a patogênese molecular do câncer de fígado e identificar novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento de fármacos. Gostaríamos de responder como o câncer inicia, metástase e progride para tolerância a drogas utilizando novos modelos de doença, como organoides derivados de pacientes. Os desafios experimentais atuais estão em dois aspectos.Primeiro, há uma falta de um conjunto completo de protocolos para a construção de organoides de carcinoma hepatocelular para todo o processo. Em segundo lugar, o tamanho dos organoides HCC cultivados é muito pequeno para processamento experimental subsequente. Neste protocolo, fornecemos os detalhes da cultura otimizada de organoides e subsequentes procedimentos de transferência e congelamento, bem como os cuidados a serem tomados durante todos os procedimentos.Otimizamos a composição do meio organoide para organoides com características teciduais próximas às originais. Podemos monitorar a evolução tumoral usando organoides derivados do paciente e tentar identificar novos alvos moleculares e terapêuticos para o tratamento do CHC.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

983 visualizações.  Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University. Nosso laboratório tem como objetivo investigar a patogênese molecular do câncer de fígado e identificar novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento de fármacos. Gostaríamos de responder como o câncer inicia, metástase e progride para tolerância a drogas utilizando novos modelos de doença, como organoides derivados de pacientes. Os desafios experimentais atuais estão em dois aspectos.Primeiro, há uma falta de um conjunto completo de protocolos para a construção de org...

Vídeo: Autor em destaque: Investigando a patogênese do câncer de fígado usando organoides derivados de pacientes 

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents necessitate further research into its pathogenesis and treatment. Organoids, a novel model that closely resembles native tumor tissue and can be cultured in vitro, have garnered significant interest in recent years, with numerous reports on the development of organoid models for liver cancer. In this study, we have successfully optimized the procedure and established a culture protocol that enables the formation of larger-sized HCC organoids with stable passaging and culture conditions. We have comprehensively outlined each step of the procedure, covering the entire process of HCC tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation, and provided detailed precautions in this paper. These organoids exhibit genetic similarity to the original HCC tissues and can be utilized for diverse applications, including the identification of potential therapeutic targets for tumors and subsequent drug development.

We provide a comprehensive overview and refinement of existing protocols for hepatocellular carcinoma (HCC) organoid formation, encompassing all stages of organoid cultivation. This system serves as a valuable model for the identification of potential therapeutic targets and the assessment of drug candidate effectiveness.

Pesquisa do câncer

Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

To begin the tissue dissociation, collect one to two cubic centimeters of hepatocellular carcinoma or HTC tissue from untreated patients. Then place the tissue in the tissue preservation solution and maintain it at four degrees Celsius until processing. Now, preheat the ultra-low attachment surface cell culture plates for one hour in an incubator set at 37 degrees Celsius.Thaw the basement membrane extract overnight at four degrees Celsius. Using surgical scissors, cut the tumor tissue into small pieces on a Petri dish inside a laminar flow hood. Transfer these pieces into a 15-milliliter conical tube and add five to 10 milliliters of basal medium.With a barotropic pipette, wash away as much blood as possible. Allow the mixture to settle for one to two minutes before removing some of the supernatant, including any blood cells and floating fat clots. Next, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at room temperature.Then carefully extract the supernatant and add five milliliters of pre-warmed digestion solution to the trimmed tissue. Place the tube at 37 degrees Celsius in a rotor for optimum digestion. After 30 minutes of initial digestion, use a microscope to look for small cell clusters.To stop the digestion, add five milliliters of cold basal medium to the tube. Then use a 100-micrometer cell filter to sieve into a new 50-milliliter tube. Fill up the tube with cold basal medium to reach a total volume of 50 milliliters.Next, centrifuge the cells at two G for 10 minutes at eight degrees Celsius. Once complete, carefully remove the supernatant liquid. Re-suspend the pellet in 50 milliliters of cold basal medium to obtain the cell pellet for organoid plating.

Dissociação tecidual do carcinoma hepatocelular para cultura de organoides

Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

To perform organoid plating, first, remove the supernatant from the centrifuge and washed hepatocellular carcinoma cells. Re-suspend the cells in the 50 microliters of basement membrane extract, or BME, per well, for plating. Next, suspend the cells in advanced DMEM/F12.Then gently pipette the cell aggregates until an even suspension is seen. Add BME to the suspension, ensuring that the BME concentration is between 30 and 50%Now seed 50 microliters of BME droplets with cell clusters in the center of a 24 well plate. Allow the droplets to solidify at 37 degrees Celsius for 20 minutes.Add 500 microliters of prewarmed medium to each well and incubate in a cell incubator at 37 degrees Celsius. Refresh the culture medium every two to three days. After two weeks, replace the isolation medium with the organoid expansion medium.After seven to 10 days of culturing, once the organoids have reached the appropriate density, process the cultures as needed. To passage the organoids, first preheat ultra low attachment surface cell culture plates in an incubator. Next, thaw the frozen BME overnight at four degrees Celsius until right before usage.Prewarm the organoid harvest solution and trypsin substitute at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Following the preparation stage, remove the culture medium from the organoid culture plate. Then transfer the organoid suspension into a 15 milliliter tube.Now add organoid harvesting solution in proportion to the amount of BME. To mix the suspension, use a 1000 microliter pipette gun to scrape and pipette up and down. After incubating the tube at room temperature for 30 minutes, use a one milliliter pipette to carefully aspirate the BME.Ensure that the BME is fully dissolved. Monitor the extract every 10 minutes until a clear organoid cell cluster is visible. Then centrifuge at room temperature at 400 g for five minutes.Remove as much of the supernatant as feasible. To start enzymatic digestion of the hepatocellular carcinoma organoids, add one to five milliliters of the prewarmed trypsin substitute to the cultured organoid pellet. Incubate the suspension at 37 degrees Celsius for two minutes.Use a microscope to verify if organoids dissociate into small clusters of two to 10 cells. To stop the digestion, add an appropriate volume of cold basal medium. Then centrifuge the organoids at 400 g for five minutes at eight degrees Celsius.Carefully remove as much supernatant as possible. Re-suspend the desired number of organoids in the proper matrix for plating. Every 10 days passage the organoids, depending on the density of organoid growth.HCC organoids spheroids were observed within three days of culture. Compact spheroids with rounded edges and permeable cytosol were seen on the initial day of establishment. Organoids were similarly sized and had the largest diameter when cultured in 30 to 50%BME.The BME was most fragmented at 10%resulting in the smallest organoids. The BME was most intact at 100%but resulted in organoids with intermediate diameter. The proliferating HCC organoid attained a size exceeding 500 micrometers in each culture after three generations.Substantially sized HCC organoids of higher than 1000 micrometers were obtained within a 20 day culture period.