A recorrência do tumor é um problema muito proeminente da ressecção do parto. Neste estudo, estamos tentando entender mais sobre o crescimento do tumor em um ambiente regenerativo. Foi demonstrado que os organoides tumorais recapitulam o tumor do paciente histológica e geneticamente, embora os modelos in vivo sejam escassos e careçam de estabilidade.
Conseguimos enxertar com sucesso o organoide derivado do paciente no fígado do camundongo. Mostramos isso para dois casos de exemplo. As colorações histológicas imuno-histoquímicas mostram que os organoides e o xenoenxerto se assemelham ao tumor original do paciente.
O desenvolvimento de organoides a partir do tumor original se assemelha a um modelo mais preciso do tumor do paciente em comparação com outras possibilidades, como culturas de células 2D. Incorporar esse modelo ao complexo ambiente de regeneração hepática ajudará a entender mais sobre as interações existentes entre as células tumorais e o ambiente regenerativo. Esperamos adquirir conhecimento para o nosso campo no que diz respeito à compreensão da recorrência do CHC da ressecção hepática.
Portanto, com este modelo, queremos criar a base para futuros projetos de pesquisa. Para começar, use um bisturi e uma pinça para cortar o tecido do câncer de fígado colhido em pequenos fragmentos de um a dois milímetros quadrados. Transfira os pedaços de tecido para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de tampão de dissociação.
Coloque o tubo em um dispositivo de rotação a 37 graus Celsius. Após a incubação, passe a mistura de células sobre um filtro de células de 100 micrômetros colocado em cima de um tubo de 50 mililitros. Use um êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para esmagar os fragmentos de tecido através do filtro.
Agora adicione cinco mililitros de DMEM avançado suplementado sobre o filtro para lavá-lo. Transferir o filtrado para um tubo cónico de 15 mililitros. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.
Centrifugue novamente a suspensão durante cinco minutos a 300 g. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS antes de contar. Antes do revestimento celular, remova o sobrenadante da suspensão da célula da centrífuga.
Ressuspenda com cerca de um mililitro de matriz de membrana basal no tubo e coloque no gelo. Pipete 20 microlitros de suspensão celular nos poços de uma placa pré-aquecida de seis poços para criar gotas. Depois de esperar dois a três minutos, coloque a placa na posição invertida em um gabinete de fluxo por cinco minutos.
Em seguida, transfira a placa para uma incubadora para solidificar. Finalmente, adicione dois mililitros de meio de cultura organoide em cada poço. A linhagem organoide derivada do paciente apresentou características morfológicas do tumor original do paciente.
Para começar, coloque um camundongo anestesiado em decúbito dorsal com os membros colados com fita adesiva. Use fórceps e tesouras microcirúrgicas para fazer uma incisão no local cirúrgico esgotado ao longo da alba linear do abdômen inferior até a cartilagem xifóide. Insira os afastadores na incisão, ajustando a direção da tração para obter a exposição ideal do abdômen superior.
Coloque um guardanapo limpo molhado com soro fisiológico ao lado do local da incisão. Agora, exteriorize o intestino delgado e o ceco no guardanapo úmido. Exponha o lobo superior direito até que uma injeção seja possível.
Puxe a mistura organoide para uma seringa Hamilton marcada com enxágue. Injete firmemente a suspensão no mouse até a marca sem mover a agulha. Aplique pressão com um cotonete no local da injeção.
Em seguida, verifique o abdômen quanto a qualquer ruptura ou refluxo do lóbulo. Enxágue o abdômen com 0,5 mililitros de solução salina estéril. Coloque uma sutura contínua com uma sutura reabsorvível para fechar o abdômen.
O tumor desenvolvido no camundongo se assemelhava tanto aos organoides derivados do paciente quanto ao tumor original do paciente. Para iniciar uma ressecção hepática menor, realize laparotomia em um camundongo anestesiado em decúbito dorsal. Com cotonetes úmidos, empurre o lobo medial cranialmente para criar mais espaço no campo cirúrgico.
Vire o lobo lateral esquerdo do fígado cranialmente para expor o lobo caudado e o ligamento. Corte o ligamento completamente. Em seguida, insira uma ligadura abaixo do lobo lateral do fígado.
Agora vire o lobo lateral esquerdo do fígado caudalmente e guie a extremidade livre esquerda da ligadura ao redor da ponta esquerda do lobo lateral esquerdo do fígado. Guie a extremidade livre direita ao redor da outra ponta. Use um cotonete para aplicar tração no lóbulo, garantindo que a ligadura esteja posicionada centralmente.
Em seguida, dê um meio nó duplo. Prenda este nó com outro segundo nó amarrado na outra direção sem apertá-lo totalmente. Quando a ligadura estiver posicionada corretamente, segure a extremidade livre cranial da ligadura com uma pinça de ponta romba e puxe a extremidade caudal com outro par de pinças.
Prenda o nó com um segundo nó amarrado na direção oposta. Corte perto da ligadura sem cortá-la para ressecar o fígado. Após a pequena ressecção do lobo lateral esquerdo do fígado, transeccionar o ligamento falciforme.
Vire o lóbulo cranialmente, insira uma ligadura abaixo dele e vire-o caudalmente. Agora enrole o ens livre da ligadura ao redor do labial. Assim que a ligadura for colocada corretamente, amarre lentamente um meio nó duplo.
Aperte totalmente um segundo meio nó na direção oposta e, em seguida, adicione um terceiro meio nó na direção oposta. Ressecção o lobo e, em seguida, lave o abdômen com solução salina estéril. Coloque os intestinos de volta em seu lugar anatômico.
Para fechar o abdômen, use uma pinça para agarrar a pele e o peritônio. Coloque um ponto com uma sutura reabsorvível na extremidade superior da linha de incisão. Faça um segundo ponto no outro lado da incisão, saindo do lado da pele.
Amarre bem o nó, deixando a extremidade livre sem a agulha curta. Deixe a ponta da agulha do ponto longa. Termine a sutura contínua com um nó na extremidade inferior da incisão.
Limpe o abdômen de qualquer sangue restante. A contribuição relativa dos lobos do fígado é comparável entre os diferentes camundongos da mesma cepa. O peso médio do lobo inferior direito aumentou para 0,82% do peso corporal total após a ressecção menor.
A ressecção maior resultou em um aumento de 0,99% do peso corporal total. A ressecção maior do lobo superior direito resultou em um aumento pronunciado de seu peso em relação ao lobo inferior direito.
