Agradecemos a todos os membros dos laboratórios Choi e Jung pela discussão metodológica. Agradecemos a C. Jang e D. Guertin pelos conselhos e feedback. Agradecemos a M.S. Choi pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por NRF-2022R1C1C1012034 para S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 para D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 para S.M.J. e D.W.C. Este trabalho foi apoiado pela Chungnam National University for W.T.K. A Figura 1 e a Figura 2 foram criadas usando BioRender (http://biorender.com/).

Todos os experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sungkyunkwan (IACUC). Os camundongos foram alojados em um biotério aprovado pela IACUC, localizado em uma sala limpa regulada para 22 °C e 45% de umidade, após um ciclo claro/escuro diário de 12 horas. Eles foram mantidos em racks ventilados e tiveram acesso a uma dieta padrão de ração ad libitum (composta por 60% de carboidratos, 16% de proteínas e 3% de gorduras). Os materiais de cama e nidificação foram trocados semanalmente. Para este estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com idade de 12 semanas e peso entre 25 g e 30 g. Estes animais foram provenientes de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Modulação da atividade metabólica do tecido adiposo marrom através da aclimatação à temperatura e estimulação farmacológica
NOTA: A aclimatação da temperatura ao longo de vários dias a semanas ou a estimulação farmacológica usando agonistas dos receptores β-adrenérgicos são métodos comumente empregados para modular a atividade da MTD1. Portanto, uma visão geral concisa do método é fornecida abaixo para permitir que os leitores escolham a abordagem apropriada, conforme necessário. Para obter MTD metabolicamente inativa (menos termogênica), uma temperatura quente basal, conhecida como termoneutralidade (28-30 °C), é selecionada para camundongos C57BL/6J. Essa faixa garante que os camundongos não precisem gastar energia extra para manter uma temperatura corporal constante. Para obter MTD metabolicamente modesta ou altamente ativa (termogênica), temperaturas de frio leve (20-22 °C) ou frio severo (6 °C) podem ser escolhidas, respectivamente. Para os propósitos deste experimento, camundongos foram criados em condições padrão de alojamento a 22 °C, que, embora levemente frias para camundongos, não envolveram nenhum estímulo farmacológico.
<ol><li>Aclimatação de temperatura<ol><li>Separe os ratos para abrigar 1 ou 2 camundongos por gaiola pelo menos 1 semana antes de iniciar a aclimatação da temperatura. Prepare incubadoras de roedores equipadas com ventilação de ar, temperatura e controle de umidade com as condições desejadas.</li>
		<li>Mover as gaiolas para suas respectivas incubadoras de roedores em dias apropriados para o tipo de aclimatação de temperatura escolhido.</li>
		<li>Certifique-se de que a distribuição do número de ratos seja uniforme em todos os grupos, com 1 ou 2 ratos por gaiola. A habitação individual é preferida por ser mais sensível às mudanças fisiológicas induzidas pela temperatura em comparação com a habitação de grupo43. Aqui estão as condições específicas de moradia para cada grupo:<ol><li>Grupo de termoneutralidade (30 °C): Manter os ratos deste grupo continuamente a uma temperatura de 30 °C durante até quatro semanas.</li>
			<li>Grupo de frio severo: Inicialmente, abrigar os camundongos deste grupo a 18 °C sem nenhum material de nidificação. Eles experimentarão uma diminuição semanal gradual da temperatura, chegando a 6 °C na quarta semana. A progressão da temperatura é a seguinte: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.</li>
			<li>Grupo de frio moderado (20-22 °C): Alojar os ratos deste grupo em incubadoras de roedores nas mesmas condições de alojamento padrão mencionadas anteriormente.</li>
			<li>Desafios de frio agudo: Para desafios de frio agudo, coloque 1-2 camundongos por gaiola sem nenhum material de nidificação e os exponha a uma incubadora de roedores fixada a 6 °C por até 8 h. NOTA: Estas condições de alojamento e variações de temperatura são essenciais para estudar os efeitos de diferentes ambientes de temperatura na atividade e metabolismo de MTD.</li>
		</ol></li>
		<li>Troque as gaiolas e reponha comida e água toda semana. Pré-aclimatar as gaiolas pelo menos 24 h antes da suplementação, em sua respectiva temperatura (incubadora de roedores). NOTA: Para evitar a perturbação do estímulo de temperatura apropriado, é importante não fornecer enriquecimento de ratos que possam levar à construção de ninhos. Em resposta ao frio intenso, os ratos gastam mais energia para manter a temperatura corporal, resultando em aumento da ingestão de alimentos e maiores taxas de excreção. Portanto, é crucial verificar as gaiolas pelo menos duas a três vezes por semana (seguindo as diretrizes institucionais locais) para garantir que os camundongos tenham um suprimento adequado de comida e água, e que as gaiolas não estejam excessivamente úmidas. Esse monitoramento é essencial para manter o bem-estar e a saúde dos camundongos durante o estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Estimulação farmacológica1 utilizando o agonista dos receptores β3-adrenérgicos CL316,243<ol><li>Para maximizar o efeito estimulatório, pré-alojar os ratos em termoneutralidade (30 °C) por 2-4 semanas antes das injeções.</li>
		<li>Após o período de aclimatação, injetar por via intraperitoneal 1 mg/kg CL316,243. NOTA: Para estimulação crônica com o agonista do receptor β3-adrenérgico (por exemplo, de 3 dias até semanas 1,44,45), injeções diárias são necessárias devido à estabilidade da droga. CL316,243 diluído deve ser preparado no dia da injeção devido à estabilidade.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coleta de sangue arteriovenoso
NOTA: Camundongos com mais de 12-14 semanas são mais recomendados para amostragem de sangue arteriovenoso. Camundongos mais jovens podem não ter veias de Sulzer suficientemente dimensionadas, um vaso sanguíneo distinto que drena especificamente o sangue venoso da MTDinterescapular 46.
<ol><li>Anestesiar suavemente com vaporizador calibrado com isoflurano a 3% para indução (em câmara de 205 x 265 x 200 mm) e isoflurano a 2% para manutenção (com máscara de anestesia gasosa). NOTA: Todo o procedimento de coleta de sangue arteriovenoso deve ser prontamente realizado após a anestesia. Uma almofada de aquecimento aquecida por água pode ser usada durante a anestesia para manter a temperatura corporal central. CUIDADO: O isoflurano é altamente volátil e tóxico quando inalado. Portanto, a anestesia primária deve ser realizada sob uma capela de fumaça.</li>
	<li>Verifique os reflexos do animal, como a retração da pata, para confirmar se a anestesia atingiu uma profundidade adequada.</li>
	<li>Coleta de sangue venoso da veia da Sulzer<ol><li>Posicione o mouse para expor a pele dorsal, confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele dorsal com amplo etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelo e faça uma incisão ao longo das costas da parte inferior do tórax até o pescoço. NOTA: A MTD interescapular está localizada logo abaixo da pele, consistindo de duas almofadas de gordura cobertas por finos tecidos adiposos brancos. É importante garantir que o rato permaneça sob anestesia através da máscara de anestesia gasosa.</li>
		<li>Levante suavemente a MTD interescapular com pinças de ponta dobrada e corte cuidadosamente os tecidos anexados, a maioria dos quais são músculos. Levante o coxim gorduroso em direção à cabeça, continue a cortar os tecidos anexados e abra cuidadosamente a região até que a veia de Sulzer (um grande vaso vermelho escuro em forma de 'Y' conectado a ambos os coxins de gordura do morcego interescapular) seja exposta. NOTA: Tenha cuidado para não cortar os vasos capilares dos tecidos musculares que estão conectados com a região frontal e lateral do BAT interescapular, pois isso reduzirá significativamente a quantidade e a qualidade do sangue que drena da veia de Sulzer.</li>
		<li>Corte cuidadosamente a veia da Sulzer e colete aproximadamente 40 μL de sangue usando pontas de pipeta de 200 μL cortadas no fundo e uma pipeta P100. Armazenar o sangue em um tubo de coleta de sangue e manter o tubo no gelo até o processo de coleta de soro. NOTA: É importante coletar sangue logo abaixo do ponto de divisão em forma de Y da veia de Sulzer, para evitar a contaminação do sangue da veia cava superior47. Coletar muito sangue diminuirá as características da veia de Sulzer. Assim, certifique-se de coletar a quantidade mínima de sangue necessária da veia da Sulzer para análise. Seja cuidadoso ao selecionar tubos de coleta de sangue, pois soro e plasma produzem diferentes perfis de metabólitos 48,49,50. Para a coleta de plasma, é necessário o uso de tubos revestidos com heparina. Neste experimento, tubos revestidos com ativador de coagulação foram escolhidos para obtenção de soro. Em nenhuma circunstância devem ser utilizados tubos revestidos com EDTA, pois o EDTA impacta significativamente os sinais de espectrometria de massa51,52.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de sangue arterial do ventrículo esquerdo<ol><li>Vire o mouse sem perder o contato com o cone do nariz, para expor a pele ventral. Confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele ventral com ampla quantidade de etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelos e abra cuidadosamente a cavidade torácica com tesoura para expor o coração sem danificar nenhuma estrutura interna.</li>
		<li>Puncione com precisão a área do ápice do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 29 G (1/2"). Inserir dois terços de uma agulha de 1/2'' a 3-5 mm na horizontal direita do ápice do coração (Figura 1B) e puxar a seringa para trás para coletar sangue do ventrículo esquerdo (50-100 μL). O sangue do ventrículo esquerdo é sangue arterial oxigenado, que é vermelho vivo. Armazenar o sangue em um tubo de coleta de sangue e manter o tubo no gelo até o processo de coleta de soro. NOTA: Uma incisão mínima deve ser feita na cavidade torácica para acesso ao coração. A incisão excessiva pode levar a sangramento local, que posteriormente pode resultar em pressão arterial baixa. Isso poderia afetar a qualidade do sangue arterial coletado do ventrículo esquerdo. Evite girar ou virar o coração, pois isso dificultará a determinação da posição precisa do ventrículo esquerdo.</li>
		<li>Realizar a eutanásia e garanti-la com um método adequado seguindo as orientações das instituições locais. Por exemplo, a eutanásia pode ser realizada através do deslocamento cervical e confirmada pela cessação dos batimentos cardíacos.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar amostras de sangue a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recolha cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta. O sobrenadante deve conter soro ou plasma, dependendo do tipo de tubo de coleta de sangue usado. Pode-se parar aqui e armazenar as amostras a -20 °C até o processamento do soro para análise de CG-EM. NOTA: A hemólise pode potencialmente ter ocorrido se o sobrenadante de cor vermelha for observado. Para evitar hemólise, vórtice a amostra antes que a coagulação seja concluída. Alguns metabólitos enriquecidos com hemácias, incluindo glutamina e lactato, podem levar a erros de interpretação dos dados, embora a maioria dos metabólitos possa não ser significativamente afetada pela hemólise. Recomenda-se analisar o soro/plasma dentro de uma semana.</li>
</ol>3. Extração de metabólitos do soro e derivatização química
<ol><li>Preparação para a extração NOTA: Todos os métodos, incluindo extração de metabólitos, derivatização e análise de dados, são versões ligeiramente modificadas dos métodos descritos anteriormente53,54.<ol><li>Preparar o tampão de extracção adicionando 100 μM de solução de DL-norvalina, padrão interno (ver Tabela de Materiais), ao metanol de grau MS.</li>
		<li>Garantir que todos os procedimentos experimentais sejam conduzidos no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira 10 μL de soro de camundongos extraído da veia de Sulzer ou do ventrículo esquerdo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 40 μL de tampão de extração.</li>
	<li>Para remover restos celulares e proteínas, agite brevemente as amostras de soro, seguido da centrifugação à velocidade máxima (18.000 x g) por 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Após centrifugação, transferir cuidadosamente 40 μL de sobrenadante para um frasco para injetáveis de vidro, seguido de 3 h de secagem numa centrífuga a vácuo a 4 °C. NOTA: Recomenda-se uma pastilha de vidro (consulte a Tabela de Materiais) em vez de tubos de plástico devido a produtos químicos reativos de plástico usados durante toda a etapa de derivatização subsequente.</li>
	<li>Submeter as amostras secas a duas etapas consecutivas de derivatização para a análise GC-MS dos metabólitos séricos. NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas sob um exaustor devido aos riscos de irritação dos solventes.<ol><li>Ressuspender os extractos de soro secos em 30 μL de cloridrato de metoxiamina 10 mg/ml (ver Tabela de Materiais) dissolvido em piridina e incubá-lo a 37 °C durante 30 minutos.</li>
		<li>Derivatizar amostras para sililação de metabolitos com 70 μL de N-metil-N-terc-butildimetilsililifluoroacetamida (MTBSTFA, ver Tabela de Materiais) a 70 °C durante 1 h. NOTA: O uso de uma seringa de vidro é recomendado em vez de uma ponta de plástico nas etapas a seguir devido aos solventes de derivatização que reagem com o plástico.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise metabolômica por CG-EM
NOTA: O GC-EM quádruplo único (ver Tabela de Materiais) foi empregado para medir os vários metabólitos séricos, incluindo carboidratos, aminoácidos e intermediários do ciclo do TCA em amostras derivatizadas da veia de Sulzer e do ventrículo esquerdo. Outras colunas podem ser usadas alternativamente, embora as configurações experimentais, incluindo o programa de temperatura, possam variar dependendo dos tipos de colunas usadas.
<ol><li>Injetar 1 μL da amostra derivatizada no CG em modo splitless a 280 °C (temperatura de entrada), usando hélio como gás carreador com vazão de 1.500 mL/min (set point).</li>
	<li>Ajuste o quadrupolo a 200 °C com interface GC-MS a 300 °C. NOTA: O programa do forno para todas as análises de metabólitos começa em 60 °C, é mantido por 1 minuto e, em seguida, é aumentado a uma taxa de 10 °C/min até que a temperatura atinja 320 °C.</li>
	<li>Coletar dados por ionização de elétrons (EI) ajustada em 70 eV e adquirir os dados da amostra no modo de varredura (50-550 m/z)53. Todos os metabólitos utilizados neste estudo foram previamente validados com padrões para confirmar espectros de massa e tempos de retenção.</li>
	<li>Realizar a integração da área de pico usando um software de análise disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Combine os compostos com o íon produto de cada derivado TBMDS. Em seguida, obtenha o cromatograma de íons de extração (EIC) integrando o valor m/z do íon fragmento na área do pico correspondente e, em seguida, exporte-o. Os íons fragmentados são mostrados na Tabela 1. NOTA: A CEI de cada composto foi normalizada pela DL-norvalina em cada amostra. Os dados são representados pela veia Log2 de Sulzer para o ventrículo esquerdo (Log2(SV/LV)) usando cada valor normalizado de EIC.</li>
</ol>

Explorando a troca de metabólitos no tecido adiposo marrom

Os autores declaram não haver conflitos de interesse a declarar.

Um passo crítico na compreensão do potencial metabólico da MTD no balanço energético de todo o corpo é definir quais nutrientes ela consome, como eles são processados metabolicamente e quais metabólitos são liberados na circulação. Esse protocolo introduz uma técnica especializada em amostragem arteriovenosa que permite o acesso à vasculatura venosa das MTD interescapulares e da vasculatura arterial sistêmica em camundongos C57BL/6J, recentemente desenvolvida e validada por Park ecols.42</...

O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma propriedade única de gasto energético conhecida como termogênese sem tremores (NST), que envolve mecanismos dependentes da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) e independentes de UCP1 1,2,3,4,5. Essas características distintas implicam MTD na regulação do metabolismo sistêmico e na patogênese de doenças metabólicas, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e caquexia por câncer 6,7,8. Estudos retrospectivos recentes têm demonstrado associação inversa entre massa de MTD e/ou sua atividade metabólica com obesidade, hiperglicemia e saúde cardiometabólica em humanos 9,10,11.
Recentemente, a MTD tem sido proposta como um sumidouro metabólico responsável pela manutenção do NST, uma vez que requer quantidades substanciais de nutrientes circulantes como combustível termogênico 6,7. Além disso, as MTD podem gerar e liberar fatores bioativos, denominados adipocinas marrons ou BATokines, que atuam como sinais endócrinos e/ou parácrinos, indicando seu envolvimento ativo na homeostase metabólica em nível de sistemas 12,13,14,15. Portanto, a compreensão do metabolismo de nutrientes da MTD deve melhorar nossa compreensão de seu significado fisiopatológico em humanos, além de seu papel convencional como órgão termorregulador.
Estudos metabolômicos empregando traçadores de isótopos estáveis, em combinação com estudos clássicos de absorção de nutrientes usando radiotraçadores não metabolizáveis, melhoraram significativamente nossa compreensão de quais nutrientes são preferencialmente absorvidos pela MTD e como são utilizados 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Por exemplo, estudos com traçadores radioativos demonstraram que a MTD ativada pelo frio absorve glicose, ácidos graxos ligados a lipoproteínas e aminoácidos de cadeia ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27 . O recente rastreamento isotópico combinado com estudos metabolômicos tem permitido medir o destino metabólico e o fluxo desses nutrientes dentro dos tecidos e células cultivadas 24,25,26,28,29,30. No entanto, essas análises se concentram principalmente na utilização individual de nutrientes, deixando-nos com conhecimento limitado dos papéis de nível de sistemas da MTD na troca de metabólitos de órgãos. As questões relativas às séries específicas de nutrientes circulantes consumidos pelas MTD e às suas contribuições quantitativas em termos de carbono e azoto permanecem indefinidas. Além disso, a exploração de se a MTD pode gerar e liberar BATokines derivadas de metabólitos (por exemplo, lipocinas) usando nutrientes está apenas começando 12,13,14,15,31,32.
A análise arteriovenosa do sangue é uma abordagem fisiológica clássica utilizada para avaliar a captação ou liberação específica de moléculas circulantes em órgãos/tecidos. Esta técnica já foi aplicada à MTD interescapular de ratos para medir oxigênio e vários metabólitos, estabelecendo a MTD como o principal sítio de termogênese adaptativa com seu potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recentemente, um estudo arteriovenoso utilizando MTD interescapular de ratos foi acoplado a uma abordagem trans-ômica, levando à identificação de BATokinas não descobertas liberadas por MTD estimulada termogenicamente38.
Avanços recentes em cromatografia gasosa de alta sensibilidade e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (GC-MS e LC-MS) têm reacendido o interesse em estudos arteriovenosos para a análise quantitativa da troca de metabólitos órgão-específicos 39,40,41. Essas técnicas, com seu alto poder de resolução e precisão de massa, permitem a análise abrangente de uma ampla gama de metabólitos usando pequenas quantidades de amostra.
Em alinhamento com esses avanços, um estudo recente adaptou com sucesso a metabolômica arteriovenosa para o estudo da MTD em camundongos, possibilitando a análise quantitativa das atividades de troca de metabólitos nas MTD em diferentes condições42. Este artigo apresenta um protocolo de metabolômica arteriovenosa direcionado para MTD usando GC-MS em um modelo de camundongo C57BL/6J.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L Filter Tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX.TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7077B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7693A Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4513A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 8890 GC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent J&#38;W GC column (Capilary column) HP-5MS UI</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433UI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3335-90240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>DBL</td>
			<td>C57BL/6JBomTac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap -50 &#176;C Cold Trap (with Stainless steel Lid)</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7811041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Norvaline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7502-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass insert 250 &#956;L&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q34966-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>226904-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette&#160;200 Serum, 200 &#181;L, cap red, flat base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1290.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBSTFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>394882-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine(anhydrous, 99.8%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators</td>
			<td>LABCONCO&#160;</td>
			<td>7310041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent diet</td>
			<td>SAFE</td>
			<td>SAFE R+40-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent incubator</td>
			<td>Power scientific</td>
			<td>RIT33SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2&#34;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>328203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Cap 9 mm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arteriovenous metabolomics to measure in vivo metabolite exchange in brown adipose tissue

O tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel crucial na regulação da homeostase metabólica através de um processo único de gasto energético conhecido como termogênese sem tremores. Para conseguir isso, a BAT utiliza um cardápio diversificado de nutrientes circulantes para suportar sua alta demanda metabólica. Além disso, a MTD secreta fatores bioativos derivados de metabólitos que podem servir como combustíveis metabólicos ou moléculas sinalizadoras, facilitando a comunicação intratecidual e/ou intertecidual mediada por BAT. Isso sugere que a MTD participa ativamente na troca de metabólitos sistêmicos, uma característica interessante que está começando a ser explorada. Aqui, apresentamos um protocolo para metbolômica arteriovenosa BAT otimizada em nível de camundongo in vivo . O protocolo se concentra em métodos relevantes para estimulações termogênicas e uma técnica de coleta de sangue arteriovenoso usando a veia de Sulzer, que drena seletivamente o sangue venoso interescapular derivado do BAT e o sangue arterial sistêmico. Em seguida, um protocolo metabolômico baseado em cromatografia gasosa usando essas amostras de sangue é demonstrado. O uso desta técnica deve expandir a compreensão da troca de metabólitos regulados por MTD em nível inter-órgão, medindo a captação líquida e liberação de metabólitos por BAT.

Brown adipose tissue (BAT) possesses a unique energy expenditure property known as non-shivering thermogenesis (NST), which involves both mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1)-dependent and UCP1-independent mechanisms1,2,3,4,5. These distinctive characteristics implicate BAT in the regulation of systemic metabolism and the pathogenesis of metabolic diseases, including obesity, type 2 diabetes, cardiovascular disease, and cancer cachexia6,7,8. Recent retrospective studies have shown an inverse association between BAT mass and/or its metabolic activity with obesity, hyperglycemia, and cardiometabolic health in humans9,10,11.
Recently, BAT has been proposed as a metabolic sink responsible for maintaining NST, as it requires substantial amounts of circulating nutrients as thermogenic fuel6,7. Furthermore, BAT can generate and release bioactive factors, referred to as brown adipokines or BATokines, which act as endocrine and/or paracrine signals, indicating its active involvement in systems-level metabolic homeostasis12,13,14,15. Therefore, understanding BAT&#39;s nutrient metabolism should enhance our understanding of its pathophysiological significance in humans, beyond its conventional role as a thermoregulatory organ.
Metabolomic studies employing stable isotope tracers, in combination with classic nutrient uptake studies using non-metabolizable radiotracers, have significantly improved our understanding of which nutrients are preferentially taken up by BAT and how they are utilized16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For instance, radioactive tracer studies have demonstrated that cold-activated BAT takes up glucose, lipoprotein-bound fatty acids, and branched-chain amino acids16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recent isotope tracing combined with metabolomic studies has allowed us to measure the metabolic fate and flux of these nutrients within tissues and cultured cells24,25,26,28,29,30. However, these analyses primarily focus on the individual utilization of nutrients, leaving us with limited knowledge of BAT&#39;s systems-level roles in organ metabolite exchange. Questions regarding the specific series of circulating nutrients consumed by BAT and their quantitative contributions in terms of carbon and nitrogen remain elusive. Additionally, the exploration of whether BAT can generate and release metabolite-derived BATokines (e.g., lipokines) using nutrients is just beginning12,13,14,15,31,32.
Arteriovenous blood analysis is a classic physiological approach used to assess the specific uptake or release of circulating molecules in organs/tissues. This technique has previously been applied to the interscapular BAT of rats to measure oxygen and several metabolites, thereby establishing BAT as the major site of adaptive thermogenesis with its catabolic potential33,34,35,36,37. Recently, an arteriovenous study using rat interscapular BAT was coupled with a trans-omics approach, leading to the identification of undiscovered BATokines released by thermogenically stimulated BAT38.
Recent advances in high-sensitivity gas chromatography- and liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS and LC-MS)-based metabolomics have reignited interest in arteriovenous studies for the quantitative analysis of organ-specific metabolite exchange39,40,41. These techniques, with their high resolving power and mass accuracy, enable the comprehensive analysis of a wide range of metabolites using small sample quantities.
In alignment with these advancements, a recent study successfully adapted arteriovenous metabolomics for studying BAT at the mouse level, enabling the quantitative analysis of metabolite exchange activities in BAT under different conditions42. This article presents a BAT-targeted arteriovenous metabolomics protocol using GC-MS in a C57BL/6J mouse model.

Autor em destaque: Iluminando novos caminhos para o metabolismo do tecido adiposo e prevenção de doenças 

Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

Our lab is interested in identifying mechanisms by which signaling pathways and metabolic pathways collaborate to regulate adipose tissue metabolism and physiology. And through that approach, we aim to find a way to prevent or target metabolic diseases caused by energy imbalances such as obesity and diabetes. The major advantage of our protocol is we have shifted from the conventional rat model to using a mouse model for arterial venous blood sampling and metabolomic analysis.We believe that this transition will allow us to validate our findings using the gold standard genetic models more rapidly for brown fat research.

A Figura 1 ilustra o esquema experimental da metabolômica AV otimizada para BAT. Como mencionado na seção Protocolo, para obter tecido adiposo marrom diferencialmente estimulado, camundongos são submetidos à aclimatação à temperatura em incubadoras de roedores ou recebem administração farmacológica, como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, camundongos são anestesiados e amostras de sangue são coletadas para análise metabolômica (Figur...

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Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Nosso laboratório está interessado em identificar mecanismos pelos quais vias de sinalização e vias metabólicas colaboram para regular o metabolismo e a fisiologia do tecido adiposo. E através dessa abordagem, pretendemos encontrar uma maneira de prevenir ou combater doenças metabólicas causadas por desequilíbrios energéticos, como obesidade e diabetes. A principal vantagem do nosso protocolo é que mudamos do modelo convencional de ratos para o uso de um modelo de camundongo para coleta de sangue venoso arterial e análise metabolômica.Acreditamos que essa transição nos permitirá validar nossos achados usando os modelos genéticos padrão-ouro mais rapidamente para a pesquisa de gordura marrom.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

1.0K visualizações.  Sungkyunkwan University (SKKU). Nosso laboratório está interessado em identificar mecanismos pelos quais vias de sinalização e vias metabólicas colaboram para regular o metabolismo e a fisiologia do tecido adiposo. E através dessa abordagem, pretendemos encontrar uma maneira de prevenir ou combater doenças metabólicas causadas por desequilíbrios energéticos, como obesidade e diabetes. A principal vantagem do nosso protocolo é que mudamos do modelo convencional de ratos para o uso de um modelo de camundongo para c...

Vídeo: Autor em destaque: Iluminando novos caminhos para o metabolismo do tecido adiposo e prevenção de doenças 

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

Bioquímica

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer's Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis

Arteriovenous Blood Sampling Technique in Mice Using Sulzer&#039;s Vein and Left Ventricle for Metabolomic Analysis  

To begin, position the mouse on a dissection tray equipped with a nose cone for anesthesia delivery. Verify the animal's reflexes, such as paw retraction, to confirm that the anesthesia has reached an appropriate depth. Then, position the mouse to expose the dorsal skin.Dampen the skin with ample 70%ethanol to prevent hair detachment. Make an incision along the back, starting from the lower part of the thorax and extend it up to the neck. Using bent tip forceps, gently lift the interscapular brown adipose tissue and carefully cut the attached tissue.Lift the fat pad toward the head and continue cutting the attached tissues to carefully open the region until the Sulzer's vein is exposed. Now, carefully cut the Sulzer's vein. Using bottom cut 200 microliter pipette tip and a P100 pipette, collect approximately 40 microliters of blood and store the collected blood in a blood collection tube.Keep the tube on ice until the serum collection process. Dampen the ventral skin generously with 70%ethanol to prevent hair detachment. Using scissors, carefully open the thoracic cavity to expose the heart.Using a one milliliter syringe equipped with a 29-gauge half inch needle, precisely puncture the apex area of the left ventricle. Insert two-thirds of the needle approximately three to five millimeters to the right horizontal of the heart apex, and pull the syringe back to collect blood from the left ventricle. Then, centrifuge the blood samples at 10, 000G for 10 minutes at four degrees Celsius.Using a pipette, collect the supernatant and proceed with metabolite extraction and analysis.