A dissecção da retina do rato é um processo realmente delicado devido ao tamanho e forma dos olhos e à fragilidade da seção de retina. Imperativo para a prática, ter um protocolo detalhado que forneça método e dicas eficientes é a chave para dissecção e seção de retina de alta qualidade. Fornecemos dicas e conselhos para ajudar o pesquisador a evitar armadilhas comuns e obter algumas seções de retina de alta qualidade adequadas para a imunohistoquímica.
Marque a parte temporal do olho de um rato eutanizado usando um cauterizador de cauda tocando a córnea muito levemente e por não mais do que uma fração de segundo para queimar ligeiramente a córnea e evitar fazer um buraco. Logo depois, usou fórceps Dumont 545 curvas para enuclear os olhos do rato. Coloque os olhos em um criobote de 1,5 mililitro com um mililitro de 4%PFA e PBS e incubar por 15 minutos no gelo.
Em seguida, transfira os olhos fixos usando os fórceps Dumont 545 curvos para um prato de dissecção modificado de 35 milímetros cheio de PBS e coloque sob microscópio dissecado. Use um microknife para fazer uma pequena incisão na marca de queimadura perpendicular para e logo acima da borda do limbus da córnea. Insira tesouras curvas na incisão e realize um corte circunferencial da córnea após o limbus.
Em seguida, usando finas fórceps Dumont 5, remova a córnea, extraia a lente e levante-a delicadamente para longe da porção posterior do olho. O corpo vítreo sairá com a lente e a retina será visível como uma superfície branca cobrindo o interior do copo ocular posterior. Lave os copos de olho isolados duas vezes em um mililitro de PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
Para proteger crio-proteger os copos oculares, equilibre-os em 15% de sacarose e PBS durante a noite a quatro graus Celsius até afundarem. Em seguida, transfira os copos oculares para 30% de sacarose e PBS por duas a três horas até afundarem. Coloque os copos oculares em OUTUBRO em 10 por 10 milímetros crio-moldes para incorporar.
Sob um microscópio dissecando, oriente o olho no crio-mold ao longo de seu eixo ventral dorsal girando o olho até que a marca de queimadura esteja em cima. O nervo óptico é um da esquerda e a parte cortada do molde fica de frente para a direita. Para quebrar o tecido da retina, mergulhe o crio-mold por pelo menos cinco minutos em um béquer de metal contendo isopéne e, em seguida, coloque o béquer em nitrogênio líquido até um terço da altura do béquer.
Remova o bloco congelado, enrole-o em papel alumínio e armazene a menos 80 graus Celsius. Use uma caneta ou Sharpie para marcar o bloco congelado para registrar sua orientação. Depois de ajustar a temperatura criostat entre menos 20 e menos 25 graus Celsius, coloque os moldes contendo os copos oculares incorporados dentro e permita que eles se equilibrem à temperatura criostat por uma hora.
Instale o bloco no criostat com a orientação ventral dorsal e comece a cortar seções de série de 10 micrômetros de espessura. Coloque cuidadosamente as seções de retina em slides de microscópio anotados e numerados e, em seguida, armazene em caixas de slides a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius até estar pronto para a imunossaturação. Imunohistoquímica com anticorpos para rhodopsina, um marcador fotorreceptor, descarboxilase de ácido glutamico 65, e marcador de células amacrinas, sintetizador de glutamina e marcador celular Muller, e calbinino, um marcador celular horizontal foi realizado em seções de retina.
Os resultados indicam que este protocolo produz seções de retina de alta qualidade e bem preservadas, ao contrário de seções de retina de baixa qualidade obtidas a partir de um protocolo diferente. Os segmentos internos e externos ricos em rodopsina permanecem verticais e intactos com pouca ou nenhuma separação do epitélio pigmentado da retina. Os interneurônios, como as células amacrinas positivas Gad65, permanecem devidamente estratificados dentro da camada nuclear interna e da camada plexiforme interna.
Além disso, as células Muller permanecem bem preservadas com soma devidamente alinhadas em processos citoplasmicos que se estendem desde a camada de células de gânglio até a camada nuclear externa. Além disso, células horizontais bem definidas são detectáveis na camada nuclear interna e na borda da camada plexiforme externa. É importante marcar a região do topper dos olhos e manter a orientação durante a incorporação.
Prepare sempre paraformaldeído sob o capô com o equipamento de proteção individual adequado.
