Agradecemos as contribuições de Dom Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Faculdade de Ciências, Charles University) para a digitalização de lâminas inteiras e o projeto "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140), que nos forneceu os recursos computacionais para este estudo. Os técnicos Jana Dosoudilova e Jan Javurek são reconhecidos por sua excelente assistência técnica. Esta pesquisa foi financiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia, concessão N°856620, e pelo Ministério da Saúde da República Tcheca, concessão AZV NU21-03-00506, e pelo Programa Cooperatio (Disciplinas cirúrgicas). A Vinicna Microscopy Core Facility é co-financiada pelo grande projeto RI da Czech-BioImaging LM2023050.

Este protocolo fez parte de um estudo realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque (versão de 2013); foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina e do Hospital Universitário de Pilsen (118/2021, 11 de março de 2021). A Figura 1 mostra um resumo dos métodos empregados.
1. Seleção de blocos de tecido FFPE
<ol><li>Recupere identificadores de bloco FFPE de arquivos de pacientes com a ajuda de médicos ou patologistas.</li>
	<li>Solicite os blocos FFPE do arquivo de patologia local.</li>
	<li>Para cada paciente, selecione 2-3 blocos FFPE contendo tecido tumoral viável, preferencialmente com a área peritumoral circundante e fígado não tumoral. NOTA: É aconselhável obter a opinião de um patologista especialista para esta seleção. A avaliação histológica do fígado não tumoral, juntamente com dados anamnésicos, clínicos e laboratoriais, foi usada para definir a etiologia subjacente do CHC.</li>
</ol>2. Desparafinização e reidratação do tecido FFPE
<ol><li>Corte uma ou duas seções de tecido de 4 μm de espessura de cada um dos blocos de tecido FFPE em um micrótomo. NOTA: A espessura das seções pode estar entre 3 μm e 5 μm sem impacto perceptível de manchas; no entanto, uma espessura de 4 μm é o padrão.</li>
	<li>Coloque as mechas em banho-maria (42°C) para remover as rugas.</li>
	<li>Monte as lâminas pegando-as e colocando-as em uma lâmina microscópica de vidro carregada positivamente. Em seguida, aplique as lâminas para secagem à temperatura ambiente (TA) por 24 h.</li>
	<li>Coloque as lâminas em um termostato (56 °C) por 1 h.</li>
	<li>Use um corador automático para desparafinizar as seções em solução de desparafinagem-1 (30 s a 72 °C), solução de desparafinagem-2 (10 s a 72 °C), solução de desparafinagem-3 (10 s em AT), etanol 96%-1 (10 s), etanol 96%-2 (10 s) e etanol 96%-3 (10 s).</li>
	<li>Use um corante automático para reidratar as seções na solução de lavagem-1 (10 s, AT), solução de lavagem-2 (10 s, AT) e solução de lavagem-3 (5 min, AT).</li>
</ol>3. Realização de IHQ em um corante totalmente automatizado
NOTA: A ICC é realizada de acordo com o protocolo do fabricante. As etapas são explicadas brevemente abaixo.
<ol><li>Método de recuperação de antígeno<ol><li>Recupere o antígeno usando o procedimento de recuperação de epítopos induzidos por calor (ER) em uma solução de ER com pH alto (por exemplo, Tris-EDTA): solução de ER-1 (10 s, AT), solução de ER-2 (10 s, AT), solução de ER-3 (20 min a 100 °C), solução de ER-4 (12 min, AT).</li>
		<li>Enxágue a lâmina em uma solução de lavagem por 3x (30 s cada) e 1x (3 min).</li>
		<li>Bloqueie a peroxidase endógena usando a solução de bloco de peróxido por 5 min em AT.</li>
		<li>Enxágue em uma solução de lavagem por 3x (30 s cada).</li>
		<li>Bloqueie a ligação inespecífica de anticorpos com um bloqueio de proteína para NKp46 apenas por 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligação com anticorpos primários: Incubar com anticorpos primários por 15 min em AT, depois enxaguar com uma solução de lavagem por 3x (30 s cada).</li>
	<li>Para ligação secundária de anticorpos, siga as etapas descritas abaixo.<ol><li>Incubar com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano por 8 min em AT.</li>
		<li>Enxágüe com uma solução de lavagem por 2x (2 min cada) e 1x com água deionizada.</li>
		<li>Visualize a reação enxaguando as lâminas com solução de diaminobenzidina (DAB) e, em seguida, incubando-as com a solução DAB por 10 min no AT.</li>
		<li>Enxágue por 3x (30 s) com água deionizada.</li>
		<li>Contra-core as seções com hematoxilina de Mayer.</li>
		<li>Enxágue com água deionizada por 1x (30 s), solução de lavagem por 1x (30 s) e água deionizada por 1x (30 s).</li>
		<li>Use um corador de lâmina totalmente automatizado para desidratar as seções em etanol 70% (2 min), etanol 80% (2 min), etanol 96%-1 (3 min), etanol 96%-2 (3 min), etanol 100% (3 min), xileno-1 (4 min), xileno-2 (4 min) e xileno-3 (4 min).</li>
		<li>Use uma lamínula de vidro totalmente automatizada para montar as seções nas corrediças em um meio de montagem. NOTA: Amostras de controle de tecido negativas e positivas (amígdalas) foram usadas por toda parte.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Obtenção de varreduras de lâminas inteiras
<ol><li>Digitalize as lâminas coradas usando a objetiva de 20x e densidade moderada-alta de foco em um scanner de lâmina inteira.</li>
</ol>5. Análise IHC usando o software
<ol><li>Crie um projeto para as imagens IHC no software.<ol><li>Baixe e abra o QuPath-0.4.3 (ou superior).exe</li>
		<li>Crie uma nova pasta com um nome adequado.</li>
		<li>Clique no botão Criar projeto no canto superior esquerdo do software e selecione a pasta recém-criada.</li>
		<li>Arraste as imagens digitalizadas para a janela do software. Quando uma nova janela aparecer automaticamente, selecione Definir tipo de imagem > H-DAB e clique em Importar (Figura 2).</li>
		<li>Observe a lista de imagens na janela esquerda do menu; Clique duas vezes para abrir a imagem.</li>
		<li>Selecione no menu principal na parte superior Arquivo para salvar as imagens como um projeto. NOTA: O software pode lidar com uma ampla variedade de formatos de imagem, incluindo muitos formatos de slides inteiros. No entanto, o formato tiff é preferido para evitar a perda de dados brutos e metadados associados.</li>
	</ol></li>
	<li>Anotar regiões de interesse<ol><li>Selecione a ferramenta Pincel ou a ferramenta Varinha no menu principal na parte superior para anotar a área do tumor. Para regiões descontínuas do tumor, siga as etapas 5.2.1.1-5.2.1.3.<ol><li>Anote-os separadamente.</li>
			<li>Pressione e segure a tecla Ctrl enquanto seleciona todas as regiões do tumor</li>
			<li>Clique com o botão direito do mouse e selecione Editar vários > Mesclar selecionados.</li>
		</ol></li>
		<li>Certifique-se de que a anotação do tumor esteja selecionada (as bordas têm uma cor amarela).</li>
		<li>Clique em Automatizar no menu principal e selecione Mostrar Editor de Scripts.</li>
		<li>Copie o script disponível no Arquivo Suplementar 1 ou em https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls e cole-o no Editor de Scripts e clique em Executar. As ROIs: centro tumoral (TC), margem interna (IM), margem externa (OM) e área peritumoral (PT) serão criadas e rotuladas automaticamente.</li>
		<li>Para obter uma maneira alternativa de criar regiões de interesse, siga as etapas 5.2.5.1-5.2.5.5.<ol><li>Selecione a ferramenta Polilinha no menu principal na parte superior para desenhar uma borda separando os ninhos de células malignas e o tecido não tumoral adjacente.</li>
			<li>Selecione a borda resultante. Selecione no menu principal na parte superior Objetos > anotação > Expandir anotações > 500 μm para Raio de expansão > Plana para Limite de linha. Ative Remover interior e ative Restringir ao pai.</li>
			<li>Clique com o botão direito do mouse na anotação resultante, Editar Divisão Única >. Duas anotações separadas serão estendidas automaticamente como regiões de 500 μm de largura em cada lado da borda.</li>
			<li>Nomeie as regiões anotadas adequadamente para IM e OM clicando com o botão direito do mouse na anotação na lista à esquerda, selecionando Definir Propriedades e inserindo o nome.</li>
			<li>O TC representa a área tumoral remanescente. Estender a área de 500 μm de TP adjacente ao OM utilizando o mesmo procedimento. NOTA: As lâminas anotadas e as detecções de FA QuPath foram revisadas por um histopatologista especialista.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Otimização da classificação de pixels<ol><li>Selecione a ferramenta Retângulo no menu principal. Em seguida, anote uma região, que contém todos os tipos de pixels a serem distinguidos (por exemplo, hematoxilina, DAB e plano de fundo).</li>
		<li>No menu principal, selecione Analisar > pré-processamento > Estimar vetor de mancha.</li>
		<li>Quando a janela Editor de Manchas Visuais aparecer automaticamente, selecione Auto > OK e defina H-DAB estimado como o nome do vetor de manchas.</li>
		<li>Para um método alternativo, siga as etapas 5.3.4.1-5.3.4.3.<ol><li>Selecione a ferramenta Retângulo no menu principal e anote uma pequena região de um núcleo típico corado com hematoxilina.</li>
			<li>Selecione Imagem no menu à esquerda e clique duas vezes em Mancha 1 > Sim.</li>
			<li>Selecione a ferramenta Retângulo no menu principal e anote uma pequena região de coloração positiva com DAB. Selecione Imagem no menu à esquerda e clique duas vezes em Mancha 2 > Sim.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação da fração de área de células imunes positivas usando a opção Classificação de Pixels .<ol><li>No menu principal, clique em Classificar > classificação de pixels > Criar limiar.</li>
		<li>Selecione Alta para a resolução > canal: DAB > Pré-filtro: Gaussiano > sigma: 0,5 > (Figura 3) Limiar: (0,2-0,3) > Acima do limite: Positivo > Abaixo do limiar: Negativo.</li>
		<li>Para a região, selecione Qualquer anotação, digite um nome para o classificador > Salvar > medida > OK. As células positivas para DAB serão alteradas para a cor vermelha (Figura 4).</li>
		<li>Copie os resultados do menu do lado esquerdo para uma planilha.</li>
		<li>Ou abra Medir no menu principal superior, selecione Mostrar medidas de anotação > Copiar para a área de transferência e cole os resultados em uma planilha.</li>
		<li>Para fechar a imagem, clique com o botão direito do mouse > Multi View > Close Viewer. NOTA: Antes da quantificação, todos os artefatos eram eliminados. O limiar foi ajustado para cada caso com uma coloração positiva específica fraca. A exatidão das anotações e a classificação de pixels foram primeiro verificadas e depois revisadas por um histopatologista sênior. Todas as análises foram feitas de forma cega. Mais informações sobre a análise da IHQ usando o software podem ser encontradas em https://forum.image.sc/tag/QP.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Métodos estatísticos e análise de dados
<ol><li>Os desfechos do estudo foram tempo de recorrência (TTR), sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS). Os pacientes sem recidiva ou óbito foram censurados no último acompanhamento. NOTA: Os dados contínuos com distribuição não normal são expressos como mediana (min-max). As proporções são expressas como dados brutos (porcentagens). As frações de área das células imunes em diferentes regiões de interesse (ROIs) foram comparadas pela ANOVA de Friedman, seguida pelo teste de pares pareados de Wilcoxon com correção de Bonferroni. Devido à distribuição não paramétrica da maioria das variáveis, a correlação de Spearman foi utilizada para avaliar as associações entre pares de variáveis ordinais ou quantitativas. Para determinar o valor prognóstico dos preditores individuais para os desfechos, foi realizada uma análise de regressão de Cox univariada seguida de multivariada. Foram calculadas as taxas de risco (HR). HR estava mostrando o risco relativo para o grupo intermediário alto combinado em comparação com 1 para o grupo baixo. Todas as estimativas de sobrevida foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas entre os grupos pelo teste de log-rank. O GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC) foi utilizado para as análises estatísticas. Um valor de p bilateral < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.</li>
</ol>

Prognostic Significance of Immune Cell Infiltration in Hepatocellular Carcinoma

Não há conflitos de interesse financeiros a serem divulgados.

Por meio do monitoramento da organização imunológica in situ no TME, o campo da imuno-oncologia pode adicionar novos biomarcadores prognósticos e preditivos do câncer. Nosso artigo publicado anteriormente sobre o papel das células imunes adaptativas no TME do CHC mostrou associações prognósticas positivas de células T CD3+ e CD8+, bem como células B CD20+ em ROIs selecionadas para o tempo de recorrência2. Aqui, o software de análise de imagem QuPath foi usado para avaliar a abundância de CD1a+ iDCs, mastócitos CD117+ e células NKp46+ NK em várias regiões distintas do CHC e avaliou sua significância prognóstica. Devido às formas irregulares de algumas células imunes inatas, sua quantificação pode ser imprecisa. É por isso que avaliar a fração de área de células imunopositivas foi a opção ideal. Entre os três tipos de células, apenas os mastócitos CD117+ demonstraram impacto prognóstico significativo: uma maior FA de mastócitos na MI e na área de TP foi associada a maior sobrevida.
Os mastócitos foram os mais abundantes em todas as ROIs, e a associação de sua FA na área peritumoral e na margem interna com melhor sobrevida reflete o papel antitumoral dos mastócitos. Os mastócitos podem ser atraídos para o TME por quimioatraentes liberados por células tumorais, como SCF ou CCL1518. Os mastócitos podem afetar a resposta antitumoral por citotoxicidade direta às células tumorais27 ou pela secreção de citocinas pró-inflamatórias que podem inibir o crescimento tumoral18. O aumento da densidade de mastócitos foi protetor contra a recorrência de câncer de próstata28, câncer gástrico27 e CHC após transplante de fígado29. Uma investigação abrangente consistindo em uma coorte maior de 245 pacientes com CHC encontrou uma correlação positiva entre infiltração de mastócitos mais significativa em amostras de tumor e sobrevida mais prolongada após a ressecção do tumor30. Rohr-Udilova et al. relataram resultados semelhantes de maiores densidades de mastócitos no tecido circundante do CHC; no entanto, apenas a densidade de mastócitos intratumorais foi associada a uma menor taxa de recorrência29.
Neste estudo, os mastócitos exerceram um efeito antitumoral apenas no fígado IM e TP. O TME de diferentes tumores é heterogêneo quanto à distribuição espacial das células imunes31. O significado prognóstico das células imunes no TME também está criticamente relacionado à sua distribuição espacial32,33. Diferentes abordagens para anotar a margem invasiva do tumor foram propostas, incluindo uma margem inteira de diferentes larguras 4,34,35, margens interna e externa, novamente com larguras diferentes36,37, com ou sem TP 2,7. Seguimos a metodologia padronizada e reprodutível do International Immunooncology Biomarkers Working Group para definir a margem invasiva como uma região de 1 mm centrada na borda que separa os ninhos de células malignas do tecido hospedeiro e representa o tumor central como a área tumoral remanescente38. Como o estudo anterior destacou diferenças significativas nos resultados da margem invasiva interna e externa2, essas regiões (cada uma com 500 μm de largura) foram analisadas separadamente. O perfil imunológico espacial da área peritumoral tem sua importância preditiva distinta 39,40 e, portanto, a área de TP também foi incluída.
A análise de CT, margem tumoral e PT hepática foi realizada em WSIs em oposição à opção de avaliar campos de visão selecionados nas respectivas regiões. A imagem de lâmina inteira é uma fonte potencialmente rica de dados41. Como não realizamos subamostragem, o "valor esperado verdadeiro" foi obtido de maneira eficiente no tempo10. Além disso, esse sistema foi razoável, pois foram analisadas apenas 1 ou 2 lâminas por bloco, o que permitiu evitar o viés de seleção de retalhos42. O fluxo de trabalho lento nos desafiou no estudo anterior, quando a estereologia foi aplicada para a quantificação de células imunes2.
A IHQ permite a localização direta da expressão de iDCs CD1a+, NKp46+NK e mastócitos CD117+ no tecido hepático, quantificação de suas distribuições e, portanto, subclassificação da coorte. A análise da IHQ confere a este estudo vantagens importantes sobre os ensaios bioquímicos em tecido solubilizado, o que pode levar a resultados falso-negativos quando apenas algumas células positivas para biomarcadores estão presentes43 e não refletem a reação regional das células imunes às características histopatológicas44. A IHQ também é preferível à análise em cortes corados com H&E. Estudos sobre câncer colorretal e câncer de pulmão de pequenas células mostraram que a avaliação de seções coradas com H & E pode fornecer biomarcadores robustos e quantitativos imunes a tumores45 , 46 , 47 ; no entanto, limitações para refletir a presença real de subtipos específicos ainda estão presentes.
A alta qualidade das seções de tecido e a coloração IHQ são um pré-requisito para uma avaliação precisa. Antecedentes altos, artefatos de borda e coloração específica, mas indesejável (por exemplo, coloração de células endoteliais dos espaços sinusoidais hepáticos com anticorpos anti-CD4) podem corromper todos os resultados. Um anticorpo CD56 foi a primeira escolha no estudo atual para detectar células assassinas naturais, mas foi substituído pelo anticorpo NKp46 devido à expressão de CD56 em ductos biliares imaturos. A seleção do marcador mais apropriado em termos de especificidade, padrão de coloração robusto e estabilidade em blocos FFPE representa outra questão a ser considerada. Por exemplo, CD117 foi escolhido em vez de triptase porque a expressão de triptase pode ser fortemente regulada negativamente, além disso, as células que não expressam CD117 não são mastócitos48.
O QuPath oferece a opção de suavizar as bordas da ROI do lado de fora e remover quaisquer artefatos, grandes vasos, tecido necrótico, coloração inespecífica, fundo e agregação de eritrócitos que não devem fazer parte da ROI. O operador precisa selecionar o ROI e pressionar a tecla "Alt" enquanto anota esses artefatos. A coloração inespecífica foi eliminada neste estudo como artefatos antes da quantificação para que não afetasse os resultados. No caso de coloração específica sistematicamente baixa ou alto fundo, o protocolo deve ser revisado para evitar possíveis vieses. O limiar foi ajustado para cada caso com uma coloração positiva específica fraca. Antes de qualquer uso rotineiro, o protocolo deve ser otimizado. Todas as análises devem ser feitas de forma cega e, idealmente, a precisão do limiar merece verificação cruzada.
O QuPath é uma solução de código aberto, intuitiva, extensível e fácil de usar para patologia digital e análise de imagens de lâminas inteiras9, testada anteriormente para análise de imagens em CHC49 e diferentes tipos de câncer50,51. A facilidade de operação do software para WSIs e as opções de anotação de regiões de interesse (por exemplo, áreas tumorais ou peritumorais) são as principais vantagens.
A aplicação de scripts existentes, modificados ou criados de novo pode acelerar substancialmente a análise. O script para criar anotações para ROIs foi aplicado, o que permitiu uma segmentação regional rápida e precisa em vez de delineamento manual. O script não é fixo e pode ser facilmente personalizado para margens inferiores a 500 μm para regiões com limites de tecido insuficientes. A largura da área IM, OM ou PT pode ser personalizada por meio do editor de script Automate > Show > adaptando a linha 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm à largura disponível > Executar. Os ROIs também podem ser adicionados ou removidos. Em geral, os fluxos de trabalho no software não são fixos e o operador é livre para desenvolvê-los e modificá-los.
Uma infinidade de ferramentas de software disponíveis para análise de imagens patológicas, incluindo CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser e outras, já estão disponíveis. No entanto, o QuPath se distingue por um conjunto de vantagens, como arquitetura de código aberto, interface amigável, recursos de personalização de algoritmos e integração de ferramentas avançadas de aprendizado de máquina. Esses recursos posicionam coletivamente este software de análise de imagem como uma escolha robusta para a análise diferenciada de tecidos cancerígenos no campo da patologia digital.
O QuPath apresentou a menor variabilidade em comparação com os softwares comerciais HALO (IndicaLab) e QuantCenter (3DHistech) para a detecção da expressão de Ki67 no câncer de mama52. O software também possui o potencial de ser instruído a executar um script para todas as imagens do projeto de maneira reproduzível de processamento em lote.
O QuPath nos permitiu criar dados quantitativos contínuos em vez de ordinais (semiquantitativos). Os dados ordinais obtidos por pontuação visual estão repletos de problemas devido à subjetividade na interpretação, variabilidade interobservador e baixa reprodutibilidade53. A prontidão da análise atual foi melhorada pelo fato de que indivíduos sem extensa formação em histopatologia e experiência em programação podem realizar análises automáticas, desde que a precisão das anotações seja verificada por um patologista. Um estudo sobre tumores de cabeça e pescoço demonstrou a adequação do QuPath para avaliação rápida e reprodutível do valor prognóstico de linfócitos infiltrantes de tumor CD57+50. O estudo também mostrou uma concordância substancial entre observadores humanos e o QuPath. Alta concordância entre observação manual e avaliação usando QuPath também foi apresentada em câncer oral54 e câncer de mama55. O artigo acima mencionado comparou a quantificação de IHC de 5 biomarcadores clínicos de câncer de mama usando QuPath e 2 produtos de software comerciais (Definiens Tissue Studio e inForm) com uma pontuação manual por um patologista. Ao longo deste estudo, o QuPath exibiu consistentemente o melhor desempenho, bem como o menor tempo de configuração e aplicação, mostrando-se assim uma excelente alternativa futura ao monitoramento visual e ao software comercial. Mesmo em comparação com o ImageJ, o software de código aberto mais conhecido para análise de imagens biomédicas, o QuPath se destaca em lidar com WSIs de grande porte56.
Existe um fórum online aberto para o QuPath, onde os usuários postam suas perguntas sobre métodos de patologia digital e apresentam uma comunidade ativa e engajada para apoiar o desenvolvimento de ferramentas para análise de imagens (https://forum.image.sc/tag/qupath).
A coorte utilizada neste estudo foi única e não representativa da população geral com CHC, pois abrangeu apenas pacientes elegíveis para ressecção hepática. Geralmente, uma minoria de pacientes com CHC (20%-30%) é elegível para ressecção hepática57. Essa também pode ser uma razão pela qual menos pacientes confirmaram cirrose, porque os pacientes com essa etiologia de CHC provavelmente tinham escores de Child-Pugh mais altos e não eram considerados ressecáveis. A coorte também foi bastante pequena e a maioria dos pacientes teve estágios iniciais de TNM da doença. Portanto, a extrapolação dos resultados para outras populações deve ser feita com cautela.
No estudo atual, a abundância de células imunes inatas no microambiente CHC foi estimada por meio da avaliação de sua FA, pois a contagem precisa de células imunes de formato irregular, como células dendríticas, pode ser difícil. Por outro lado, a fração de área das células imunes geralmente se correlaciona fortemente com suas densidades58. A marcação da imunoperoxidase fornece dados para a localização do antígeno, fração de área ou densidade das células que a expressam, mas a intensidade da coloração não está linearmente relacionada à quantidade de antígeno. Portanto, a IHQ não deve ser usada para avaliar quantitativamente o nível de expressão de uma proteína específica. A precisão do método também depende da uniformidade da espessura da seção, qualidade da imagem e resolução selecionada para classificação de pixels. Quaisquer resultados da análise de imagem devem ser validados e tratados com cautela. Como um único marcador não pode capturar totalmente a complexidade das células imunes, mais marcadores IHC e coloração multiplex são necessários para obter uma imagem confiável do TME imunológico do CHC. O uso de apenas um único marcador IHQ para fenotipagem de células imunes representa uma aproximação, e os resultados devem ser interpretados com cautela.
O uso do software de análise de imagem QuPath para avaliar as lâminas coradas com IHC nos permitiu avaliar a distribuição e a fração de área de iDCs locais, mastócitos e NKs em tumor e peritumor de pacientes com CHC e, em seguida, analisar suas relações com o prognóstico. A abundância de mastócitos na margem interna e no fígado peritumoral do CHC está associada a DFS e OS mais longos, destacando os efeitos antitumorais dessas células imunes inatas. O fluxo de trabalho analítico do QuPath é amigável, rápido e fácil de usar, com configurações padrão úteis e fácil exportação de dados. Este software foi endossado como uma plataforma promissora para análise de imagens digitais, que poderia atender à necessidade de reprodutibilidade, consistência e precisão em patologia digital.

A organização espacial e a abundância de células imunes infiltrantes de tumor comprovadamente afetam a sobrevida em diferentes tipos de câncer, incluindo o carcinoma hepatocelular (CHC) 1,2,3,4. O significado prognóstico dos linfócitos infiltrantes tumorais em cânceres foi demonstrado pela primeira vez em cortes corados com hematoxilina e eosina (H&E) 5,6. Em seguida, um estudo pioneiro de Galon et al. usando imuno-histoquímica (IHQ) demonstrou associações das densidades de células T CD3+ e CD8+ no tecido de câncer de cólon com prognóstico4.
A IHQ é um padrão-ouro para visualizar, quantificar e mapear células imunes dentro do tecido tumoral para posterior associação com resultados clínicos7. A IHQ apresenta várias vantagens, como baixo custo, ampla disponibilidade e compatibilidade com tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE)8. No entanto, a avaliação precisa das células imunes coradas com IHC é um grande desafio. A pontuação tradicional em campos de visão microscópicos selecionados é demorada e não é mais suficiente para garantir a análise objetiva, reprodutível e de alta qualidade, essencial para a seleção de biomarcadores candidatos e correlação clínica confiável9. As varreduras de lâminas inteiras podem ser avaliadas como uma imagem inteira ou após subamostragem10.
A avaliação quantitativa computadorizada da abundância de células imunes em amostras de tecido pode garantir dados práticos, precisos, confiáveis e clinicamente relevantes11. O QuPath é um software gratuito e de código aberto que permite a análise de imagem digital de lâminas coradas com IHC e maximiza a quantidade de informações obtidas a partir de amostras individuais12.
Uma vez que as células dendríticas imaturas (iDCs), as células natural killer (NK) e os mastócitos estão envolvidos nas respostas imunes antitumorais e demonstraram se correlacionar com os resultados dos pacientes 13,14,15, apresentamos aqui um protocolo passo a passo para avaliar sua distribuição espacial no tecido FFPE CHC e explorar seu impacto prognóstico. O CD1a é expresso principalmente na membrana de células dendríticas imaturas, cuja densidade tem sido associada a desfechos clínicos em uma variedade de tumores humanos 16,17. Os mastócitos podem desempenhar um papel pró-tumoral ou antitumoral dentro do microambiente tumoral (TME)18. Eles podem apoiar a angiogênese e facilitar a metástase19. Por outro lado, foi relatado que os mastócitos podem mediar a apoptose das células tumorais por meio da produção de IL-420. A coloração anti-CD117 é comumente usada para visualizar e quantificar mastócitos dentro do tecido tumoral21. Acredita-se que as células NK contribuam para a vigilância e controle do CHC22, matando as células cancerígenas23. A expressão de NKp46 por NK é um parâmetro crucial para sua atividade antitumoral24. No entanto, as células NKp46+ NK correlacionaram-se positivamente com o diâmetro do tumor em pacientes com CHC25. Apesar disso, pouco se sabe sobre sua correlação com a sobrevida dos pacientes.
Nosso objetivo foi avaliar quantitativamente a abundância de CD1a+ iDCs, mastócitos CD117+ e células NKp46+ NK em diferentes regiões do CHC e destacar sua significância prognóstica. Um total de 70 pacientes consecutivos com CHC estágio I-IV confirmado patologicamente, que eram elegíveis para ressecção de acordo com as diretrizes do BCLC e foram submetidos à ressecção hepática com intenção curativa no Hospital Universitário de Pilsen entre 1997 e 2019, foram incluídos no estudo retrospectivo atual. Os relatórios anatomopatológicos dos pacientes foram revisados. Nenhum dos pacientes incluídos neste estudo apresentou metástases à distância nem recebeu terapia neoadjuvante, como quimioterapia ou radioterapia, antes da cirurgia. Um total de 3 pacientes com peças histológicas de baixa qualidade foram excluídos, e os 67 pacientes restantes foram incluídos no estudo (Tabela 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD1a</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>PA0235</td>
			<td>Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD117</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>&#160;PA0007</td>
			<td>Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Plus Microscope Slides</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>S21.2113.A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND RXm</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>49.1501</td>
			<td>Fully Automated IHC Stainer&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe Cleaning Kit</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CS9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond&#160;Dewax&#160;Solution</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond&#160;Polymer Refine Detection Kit</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BondTM Epitope Retrieval 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BondTM Primary Antibody Diluent</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BondTM Wash Solution 10X Concentrate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz&#160;&#160; 3.10 GHz Installed RAM: 128 G</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>14071135636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV Mount</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>14046430011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>149CVTS5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven UN30</td>
			<td>Memmert GmbH&#160;</td>
			<td>UN30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9.0</td>
			<td>GraphPad Software LLC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc., United States</td>
			<td>MAB1850</td>
			<td>Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HI1210 - Water Bath</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14041521466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Block</td>
			<td>Agilent Dako, United States</td>
			<td>X0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2 or higher versions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;version (QuPath v.0.3.2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2235 Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>149AUTO00C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST5020 Multistainer Slide Stainer</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DEV-ST5010-CV5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistica</td>
			<td>StatSoft Inc.</td>
			<td></td>
			<td>version 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scan.Z1</td>
			<td>ScienceServices GmbH, Germany</td>
			<td>430038-9000-000&#160;</td>
			<td>Slide scanner&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mast cells in the microenvironment of hepatocellular carcinoma confer favorable prognosis: a retrospective study using qupath image analysis software

Os insights fornecidos pela detecção in situ de células imunes no carcinoma hepatocelular (CHC) podem apresentar informações sobre os resultados dos pacientes. Estudos que investigam a expressão e localização de células imunes dentro de tecidos tumorais estão associados a vários desafios, incluindo a falta de anotação precisa para regiões tumorais e seleção aleatória de campos de visão microscópicos. O QuPath é um software de código aberto e fácil de usar que pode atender à crescente necessidade de patologia digital na análise de imagens de lâmina inteira (WSI).
A infiltração de CHC e tecidos adjacentes por células dendríticas imaturas CD1a+ (iDCs), mastócitos CD117+ e células natural killer (NKs) NKp46+ foi avaliada imunohistoquimicamente em espécimes representativos de 67 pacientes com CHC submetidos à ressecção curativa. A fração de área (FA) das células coradas positivamente foi avaliada automaticamente em WSIs usando QuPath no centro do tumor (TC), margem interna (IM), margem externa (OM) e área peritumoral (PT). A significância prognóstica das células imunes foi avaliada quanto ao tempo de recorrência (TTR), sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS).
A FA dos mastócitos foi significativamente maior do que a FA das NKs, e a FA das iDCs foi significativamente menor em comparação com as NKs em cada região de interesse. FAs altas de mastócitos nas áreas IM e PT foram associadas a DFS mais longo. Além disso, a alta FA de mastócitos na MI foi associada a uma SG mais longa.
A análise assistida por computador usando este software é uma ferramenta adequada para obter informações prognósticas para células imunes infiltrantes de tumor (iDCs, mastócitos e NKs) em diferentes regiões do CHC após a ressecção. Os mastócitos exibiram a maior FA em todas as regiões de interesse (ROIs). Os mastócitos na região peritumoral e IM mostraram significância prognóstica positiva.

The spatial organization and abundance of tumor-infiltrating immune cells have been proven to impact survival in different cancers, hepatocellular carcinoma (HCC) included1,2,3,4. The prognostic significance of tumor-infiltrating lymphocytes in cancers was first shown on hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections5,6. Then, a pioneer study by Galon et al. using immunohistochemistry (IHC) demonstrated associations of the densities of CD3+ and CD8+ T cells in colon cancer tissue with prognosis4.
IHC is a gold standard for visualizing, quantifying, and mapping immune cells within tumor tissue for further association with clinical outcomes7. IHC presents several advantages, such as low cost, widespread availability, and compatibility with formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue8. However, accurate assessment of IHC-stained immune cells is a big challenge. Traditional scoring in selected microscopic fields of view is time-consuming and no longer sufficient to ensure the high-quality, reproducible, objective analysis essential for candidate biomarker selection and reliable clinical correlation9. Whole-slide scans can be assessed as a whole image or after subsampling10.
Computerized quantitative assessment of the abundance of immune cells in tissue samples can ensure practical, accurate, reliable, and clinically relevant data11. QuPath is a free, open-source software that enables the digital image analysis of IHC-stained slides and maximizes the amount of information yielded from individual samples12.
Since immature dendritic cells (iDCs), natural killer (NK) cells, and mast cells are involved in anti-tumor immune responses and were shown to correlate with patients&#39; outcomes13,14,15, we here present a step-by-step protocol for assessing their spatial distribution in FFPE HCC tissue and exploring their prognostic impact. CD1a is expressed mainly on the membrane of immature dendritic cells, the density of which has been associated with clinical outcomes in a variety of human tumors16,17. Mast cells can play a protumor or anti-tumor role within the tumor microenvironment (TME)18. They can support angiogenesis and facilitate metastasis19. Conversely, it has been reported that mast cells can mediate tumor cell apoptosis through the production of IL-420. Anti-CD117 staining is commonly used to visualize and quantify mast cells within the tumor tissue21. NK cells are thought to contribute to the surveillance and control of HCC22 by killing cancer cells23. NKp46 expression by NK is a crucial parameter for their anti-tumor activity24. However, NKp46+ NK cells correlated positively with tumor diameter in HCC patients25. Despite this, little is known about their correlation with patient survival.
We aimed to quantitatively assess the abundance of CD1a+ iDCs, CD117+ mast cells, and NKp46+ NK cells in different regions of HCC and highlight their prognostic significance. A total of 70 consecutive patients with pathologically confirmed stage I-IV HCC, who were eligible for resection according to BCLC guidelines and underwent curative-intent liver resection at Pilsen University Hospital between 1997 and 2019, were included in the current retrospective study. Pathology reports of the patients were reviewed. None of the patients included in this study had distant metastases nor had received neoadjuvant therapy such as chemotherapy or radiotherapy before surgery. A total of 3 patients with poor-quality histological specimens were excluded, and the remaining 67 patients were included in the study (Table 1).

Author Spotlight: Investigating Immune Cell Dynamics in the Tumor Microenvironment &amp;#8212; Challenges and Innovations in Cancer Prognosis

Mastócitos no microambiente do carcinoma hepatocelular conferem prognóstico favorável: um estudo retrospectivo usando o software de análise de imagem QuPath 

As características demográficas e clínicas dos pacientes são apresentadas na Tabela 1. A mediana de idade dos pacientes foi de 69 anos, sendo a maioria do sexo masculino (77,6%). Em relação à etiologia do CHC, a hepatite crônica não viral foi a doença de base mais frequente, com prevalência de esteato-hepatite não alcoólica (EHNA) (23,9%). Apenas 15 pacientes (22,4%) tinham cirrose como doença de base. A maioria dos pacientes (68,7%) tinha TNM estágio I. Achados clínicos e anatomopatológicos mais detalhados foram descritos em nosso trabalho publicado anteriormente 2,26.
Resultados No último acompanhamento, a recidiva tumoral foi observada em 29 (41,8%) pacientes, dos quais 89,7% apresentaram recidiva local e 38 (56,7%) pacientes foram a óbito. Aos 5 anos após a cirurgia, a proporção de SLD foi de 33,2%, a proporção OS foi de 49,4% e a proporção livre de recidiva (RFP) foi de 48,7% (Tabela 2).
Distribuição de células imunes em diferentes regiões de interesse A proteína CD117 foi encontrada predominantemente na membrana citoplasmática de células arredondadas (Figura 5A). No CT e IM, eles estavam localizados principalmente no estroma e no espaço perivascular. Nas áreas de MO e TP, as células CD117+ foram observadas na cápsula tumoral e no espaço perivascular.
A proteína NKp46 foi encontrada principalmente na membrana citoplasmática de células arredondadas, que estavam presentes dentro de espaços semelhantes sinusóides no CT e IM, além de estarem associadas ao estroma (Figura 5B). Na área de MO e TP, células NKp46+ foram observadas em cápsulas ao redor de ninhos tumorais e no estroma dos tratos portais.
A proteína CD1a foi encontrada no CT e IM, principalmente na membrana citoplasmática de células arredondadas (espalhadas ou em agregados) no estroma, dentro e ao longo dos limites dos espaços sinusóides (Figura 5C). Na área de TP, CD1a+ DC foi observada dentro e ao longo dos limites dos sinusóides e dentro do epitélio biliar nas vias portais.
A FA dos mastócitos foi significativamente maior do que a FA das células NKp46+ (p < 0,001) (Figura 6). As CD1a+ iDCs em cada ROI apresentaram a menor FA em comparação com mastócitos e células NK (p < 0,001) (Figura 6). A FA das células CD117+ e NKp46+ em CT ou IM foi significativamente menor do que as da área de TP e MO (p < 0,001) (Figura 6). Para as células CD1a+, a FA não diferiu significativamente entre as regiões.
Associações significativas para células imunes individuais entre todas as ROIs são mostradas na Tabela 3. A Figura 7 mostra o mapa de calor para associações significativas entre diferentes células imunes em diferentes regiões. A FA de mastócitos CD117+ em CT correlacionou-se significativamente com a FA de CD1a no CT e IM.
Valor prognóstico das variáveis clínicas e anatomopatológicas Entre as variáveis clínicas e anatomopatológicas, apenas a idade mais jovem foi associada a um maior risco de recorrência (HR = 0,96, IC: 0,93-0,99, p = 0,007), enquanto nenhuma variável foi associada a SLD e SG (Tabela 4).
Valores prognósticos de células imunes infiltrantes Uma FA elevada de mastócitos CD117+ no MI foi associada a DFS mais longo (HR = 0,48, IC: 0,241 - 0,935, p = 0,031) e SG (HR = 0,34, IC: 0,167 - 0,703, p = 0,004) (Figura 8, Tabela 5). Além disso, uma FA elevada de mastócitos CD117+ na área de TP foi associada a DFS mais longo (HR = 0,48, IC: 0,247 - 0,945, p = 0,034) (Figura 8, Tabela 5). Por outro lado, as FAs das células iDC e NK não foram associadas a nenhum dos desfechos. Os mastócitos CD117+ na margem interna mantiveram associações significativas com DFS (HR = 0,46, IC: 0,23-0,91, p = 0,027) e OS (HR = 0,33, IC: 0,16-0,68, p = 0,003) após ajuste para o estágio TNM (Tabela 6). Quanto aos mastócitos na região do TP, a associação com DFS também permaneceu significativa (HR = 0,47, IC: 0,24-0,93, p = 0,029) (Tabela 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig01.jpg"> Figura 1: Esquema representativo para os métodos. Diagrama esquemático do fluxo de trabalho para identificação do papel prognóstico de mastócitos, células dendríticas e células natural killer no CHC. Abreviaturas: FFPE, embebido em parafina fixado em formalina; H&E, Hematoxilina e Eosina; ROIs, regiões de interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig02.jpg"> Figura 2: Captura de tela da janela do software. Uma captura de tela descritiva mostrando a etapa de importação de imagens para um projeto no software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig03.jpg"> Figura 3: Captura de tela da opção de fração de área. Uma captura de tela do software mostrando os parâmetros selecionados para quantificar a fração de área da coloração positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig04.jpg"> Figura 4: Captura de tela da opção de classificação de pixels. Captura de tela do software mostrando as células positivas DAB antes e depois da classificação de pixels. A coloração DAB acastanhada foi convertida para a cor vermelha após a classificação de pixels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig05.jpg"> Figura 5: Imunocoloração representativa de células imunes inatas em pacientes com CHC. Imunomarcação representativa de (A) CD117+, (B) NKp46+ e (C) células CD1a+ em TC (400x) e TIM (200x) de CHC. Abreviaturas: CHC, carcinoma hepatocelular; CT, centro tumoral; TIM, margem invasiva do tumor, com margem interna (IM) e margem externa (MO). A linha pontilhada representa uma fronteira entre o tecido tumoral e não tumoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig06.jpg"> Figura 6: Estatísticas que descrevem a fração de área das células imunes inatas em pacientes com CHC. Estatísticas para a fração de área de células dendríticas CD1a +, mastócitos CD117 + e células NKp46 + NK) nas áreas TC, IM, OM e PT do CHC. As linhas pretas são medianas. O teste de pares pareados de Wilcoxon com correção de Bonferroni foi utilizado para comparações. Abreviaturas: CHC, carcinoma hepatocelular; CT, centro tumoral; como primário, margem interna; OM, margem externa; TP, área peritumoral. : p <0,001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig07.jpg"> Figura 7: Mapa de calor de correlações significativas entre frações de área de mastócitos, DCs e NKs em diferentes regiões de interesse. Mapa de calor de correlações significativas entre frações de área de mastócitos CD117+, CD1a+ DCs e NKp46+NKs em TC, IM, OM e PT (Spearman ρ, p < 0,05). Abreviaturas: TC, centro tumoral; como primário, margem interna; OM, margem externa; TP, área peritumoral; DC, células dendríticas; NK, células assassinas naturais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig08.jpg"> Figura 8: Curvas de Kaplan-Meier DFS e OS para mastócitos infiltrantes de tumor em pacientes com CHC. Análise de Kaplan-Meier de DFS e OS de acordo com FA baixa vs. alta de mastócitos infiltrantes de tumor na margem interna (A, C) e PT (B) do CHC. Abreviaturas: CHC, carcinoma hepatocelular; DFS, sobrevida livre de doença; como primário, invasivo interno; TP, área peritumoral. A figura foi adaptada com permissão de Ali et al.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Antecedentes clínicos dos pacientes com carcinoma hepatocelular incluídos. Antecedentes clínicos dos casos inscritos de carcinoma hepatocelular. Abreviaturas: DHGNA, doença hepática gordurosa não alcoólica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Probabilidade estimada de desfechos na análise de Kaplan-Meier. A probabilidade estimada de RFP, DFS e OS na análise de Kaplan-Meier. Abreviaturas: RFP, proporção livre de recorrência; DFS, sobrevida livre de doença; OS, sobrevida global. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Correlação entre a fração de área de mastócitos infiltrantes de tumores, células dendríticas e células natural killer em diferentes ROIs. Correlação de Spearman (ρ) entre a fração de área de mastócitos infiltrantes de tumores, células dendríticas e células natural killer em diferentes ROIs, p < 0,038. Abreviaturas: TC, centro tumoral; como primário, margem interna; OM, margem externa; TP, área peritumoral; ROIs, regiões de interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%203.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 4: Análise univariada de variáveis clínicas e patológicas associadas ao tempo de recorrência (TTR), sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS). " Não", sexo feminino ou "A" foram as categorias de referência para as variáveis dicotômicas. Valores em negrito indicam significância estatística no nível de p < 0,05. Abreviaturas: HR, taxa de risco; IC, intervalo de confiança; TTR, tempo até a recorrência; DFS, sobrevida livre de doença. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%204.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 5: Análise univariada da associação da fração de área de mastócitos CD117+, células CD1a+denderíticas e células NKp46+natural killer com TTR, DFS e OS por região individual de interesse usando a regressão de Cox (67 pacientes com CHC). A fração de área de células imunes por seção de área (mm2) foi convertida em percentis e, em seguida, categorizada em baixa (percentil 0-25) versus alta (percentil 25-100). As taxas de risco mostram o risco relativo em comparação com 1 para a FA baixa. Valores em negrito indicam significância estatística no nível de p < 0,05. Abreviaturas: AF, fração de área; DFS, sobrevida livre de doença; OS, sobrevida global; HR, taxa de risco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%205.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 6: A fração de área de mastócitos CD117+ por ROI individual associada à sobrevida livre de doença e sobrevida global (análise multivariada). Análise multivariada da associação da fração de área de mastócitos CD117+ com DFS e OS na área IM e TP usando regressão de Cox (67 pacientes com CHC). A fração de área de células imunes por seção de área (mm2) foi convertida em percentis e então categorizada em baixa (percentil 0-24) versus alta (percentil 25-100). As taxas de risco mostram o risco relativo em comparação com 1 para a FA baixa. Valores em negrito indicam significância estatística no nível de p > 0,05. Abreviaturas: AF, fração de área; DFS, sobrevida livre de doença; OS, sobrevida global; HR, taxa de risco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%206.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo Suplementar 1: Script para criação de ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Supplemental%20File%20(Script%20for%20ROI).zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software at JoV

A presença de mastócitos na margem interna e áreas peritumorais do carcinoma hepatocelular após a ressecção confere um prognóstico favorável. Este estudo endossa o software de análise de imagens QuPath como uma plataforma promissora que pode atender à necessidade de reprodutibilidade, consistência e precisão em patologia digital.

The insights provided by in-situ detection of immune cells within hepatocellular carcinoma (HCC) might present information on patient outcomes. Studies ...

Nós nos concentramos em avaliar a distribuição de células imunes dentro do microambiente tumoral. Em primeiro lugar, auxiliamos a infiltração de células imunes na amostra do tumor e no tecido não tumoral adjacente e, em seguida, determinamos seu impacto prognóstico no carcinoma hepatocelular. O primeiro desafio é a complexidade das estruturas tumorais, o que torna a separação entre tecido tumoral e não tumoral desafiadora.Além disso, os mísseis manuais para certificação são demorados. Além disso, a coloração inespecífica é um problema hereditário para todos os métodos de imuno-histoquímica. O aumento do prognóstico conferido pelas células-mestre na área do tumor enterrado e na margem interna defende mais pesquisas sobre células-mestre no carcinoma hepatocelular e outros tipos de câncer.Essa análise se beneficiaria do uso de software de análise de energia para anotação precisa da região de interesse e para quantificar corretamente as células imunes.

mast-cells-microenvironment-hepatocellular-carcinoma-confer-favorable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software

818 visualizações.  Charles University. Nós nos concentramos em avaliar a distribuição de células imunes dentro do microambiente tumoral. Em primeiro lugar, auxiliamos a infiltração de células imunes na amostra do tumor e no tecido não tumoral adjacente e, em seguida, determinamos seu impacto prognóstico no carcinoma hepatocelular. O primeiro desafio é a complexidade das estruturas tumorais, o que torna a separação entre tecido tumoral e não tumoral desafiadora.Além disso, os mísseis manuais para certificaçã...

Vídeo: Author Spotlight: Investigating Immune Cell Dynamics in the Tumor Microenvironment &#8212; Challenges and Innovations in Cancer Prognosis

The insights provided by in-situ detection of immune cells within hepatocellular carcinoma (HCC) might present information on patient outcomes. Studies investigating the expression and localization of immune cells within tumor tissues are associated with several challenges, including a lack of precise annotation for tumor regions and random selection of microscopic fields of view. QuPath is an open-source, user-friendly software that could meet the growing need for digital pathology in whole-slide image (WSI) analysis.
The infiltration of HCC and adjacent tissues by CD1a+ immature dendritic cells (iDCs), CD117+ mast cells, and NKp46+ natural killer cells (NKs) cells was assessed immunohistochemically in representative specimens of 67 patients with HCC who underwent curative resection. The area fraction (AF) of positively stained cells was assessed automatically in WSIs using QuPath in the tumor center (TC), inner margin (IM), outer margin (OM), and peritumor (PT) area. The prognostic significance of immune cells was evaluated for time to recurrence (TTR), disease-free survival (DFS), and overall survival (OS).
The AF of mast cells was significantly greater than the AF of NKs, and the AF of iDCs was significantly lower compared to NKs in each region of interest. High AFs of mast cells in the IM and PT areas were associated with longer DFS. In addition, high AF of mast cells in IM was associated with longer OS.
Computer-assisted analysis using this software is a suitable tool for obtaining prognostic information for tumor-infiltrating immune cells (iDCs, mast cells, and NKs) in different regions of HCC after resection. Mast cells displayed the greatest AF in all regions of interest (ROIs). Mast cells in the peritumor region and IM showed a positive prognostic significance.

The presence of mast cells in the inner margin and peritumor areas of hepatocellular carcinoma after resection confers a favorable prognosis. This study endorses QuPath image analysis software as a promising platform that could meet the need for reproducibility, consistency, and accuracy in digital pathology.