Os autores gostariam de agradecer à equipe técnica da Unidade de Pesquisa translacional; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ea Equipe de Informática no Instituto de Patologia da Universidade de Berna.

NOTA: Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética local do Hospital Insel, Berna, Suíça (07-10-13). Os tecidos foram obtidos a partir do banco de tumores Bern, Instituto de Patologia, Universidade de Berna. 1 Planejamento e Desenho (Consulting) <ol><li> Pense sobre a questão de pesquisa a ser respondida. Decidir sobre os tipos de tecidos a serem incluídos no projeto. Determine o que estruturas histológicas são importantes para responder a pergunta. </li><li> Determinar o diâmetro do núcleo mais útil e do número de núcleos por paciente para o projeto. Decidir sobre o número de cópias do tecido da próxima geração Micro Array (ngTMA) com base na quantidade de biomarcadores para ser investigado. </li><li> Considere aspectos estatísticos, tais como o tamanho da amostra e análise após o tissue microarray (TMA) é construído. Determinar o número de pacientes de inclusão no estudo e controlo de estabelecimento de tecidos para a matriz. </li><li> Recuperar o histológico (oudiagnóstico) Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) lâminas de cada paciente. Faça uma breve revisão das lâminas e identificar aqueles que contêm informações e histologia relevantes para o projeto. NOTA: Faça novas seções dos blocos de parafina, se corante especial ou imunohistoquímica slide é pretendido para a digitalização de slides e anotações, em vez de H &amp; E diapositivos </li></ol> 2 Deslize Scanning <ol><li> Ligue o PC e scanner de slides e software de digitalização aberta. Selecione &quot;modo automático&quot; para a digitalização de campo claro da tela de visualização. </li><li> Clique em &quot;Opções de verificação&quot; para ajustar os parâmetros de qualidade de slides. Neste momento, selecione se os slides devem ser digitalizados diretamente para a plataforma digital acessível por web ou em uma unidade local (ou disco rígido externo) e definir os tipos de varredura eo número de pontos de focagem. </li><li> Clique em &quot;Parâmetros do Servidor&quot; para digitalizar para o &quot;centro de Caso&quot;. Nesta etapa, adicionar mais revistas, rotular todos os slides e definira pasta no processo Center, onde os slides devem ser armazenados. Cada revista tem capacidade para até 25 slides. </li><li> Verifique a qualidade / limpeza de lâminas histológicas reais para a digitalização. Se necessário, as lâminas limpas com etanol 70%. </li><li> Carregue até 25 lâminas por revista com os rótulos virados para dentro (Figura 3A) </li><li> Coloque a revista no scanner. Para mais do que um compartimento, colocá-los uns em cima dos outros. </li><li> Comece a digitalizar slides, clicando na seta verde (Figura 3B). Quando todos os slides são digitalizados, descarregar as revistas e desligue o scanner de programa, PC e slide. </li></ol> 3 Deslize Digital Anotação <ol><li> Digite o endereço do navegador para o centro de gestão de slides digital e baixar o software visualizador de slides digital gratuito. </li><li> Abra o software visualizador de slides digitais e selecione a pasta que contém os slides digitais (Figura 4A). </li><li> Adicionar notas, reorganizar e administrar a digitapasta de slides l ou atribuir direitos de usuário para os colegas ou adicionar anexos à pasta. </li><li> Clique no slide digital desejado que aparece no visualizador de slides digital. </li><li> Usando a ferramenta de ampliação, avaliar o slide e encontrar as áreas de interesse para a integração no ngTMA. </li><li> Usando a &#39;ferramenta de anotação TMA &quot;, selecione o tamanho do núcleo desejado ea cor da anotação. Coloque a anotação no slide digitais, clicando sobre ela (Figura 4B). </li><li> Mover a anotação das estruturas histológicas desejados para incorporação no ngTMA (Figura 4C). </li><li> Repita esse processo de anotação novamente usando a ferramenta de anotação, selecionar um tamanho de núcleo e uma cor anotação desejada. Repita a visualização de slides e anotações em todos os slides na pasta. </li><li> Alternativamente, coloque núcleos de tecido para PCR em tubos de 0,2 ml em vez de integração no TMA. Anotar os slides usando uma cor diferente para identificarestes pontos para análise molecular. </li><li> Criar uma lista de todos os casos com suas anotações e cores correspondentes. </li></ol> 4. Tissue Microarray Construção <ol><li> Recupere os blocos de tecido parafina correspondentes para todos os slides digitais anotados, classificar os blocos na ordem desejada para microarraying tecido. </li><li> Certifique-se de que os blocos de tecido ter um mínimo de espessura de 4 mm. Se não, reencaixe de tecido é necessário. </li><li> Ligue o PC &quot;ON&quot; e de tecido automático instrumento microarrayer. Abra o software microarrayer tecido e fornecer um nome para o projeto </li><li> Executar uma &quot;ferramenta Change&quot; e selecione o diâmetro da ferramenta necessária para o projeto (ou seja, 0,6, 1,0, 1,5 ou 2,0 mm). </li><li> Carregue até 12 blocos de &quot;destinatário&quot; do TMA na máquina. Dê um ID para cada um dos 12 blocos </li><li> Criar um layout TMA para cada bloco receptor. Observar um projeto TMA com número de linhas, colunas e emptlinhas de y, assim como a distância entre os núcleos. Criar um novo layout para cada bloco receptor ou usar o mesmo layout repetidamente. </li><li> Coloque o cursor sobre o layout bloco receptor para dar o primeiro núcleo. </li><li> Em seguida, carrega-se para 60 blocos dadores na microarrayer tecido (Figura 5A). Coloque dez blocos em cada linha de A a F. Dar a cada bloco de uma identificação dos doadores. Observar imagens de cada bloco doador na tela do computador adquirido automaticamente pelo microarrayer tecido. </li><li> Começando com o primeiro bloco, clique em &quot;Slide&quot;. Observe o slide digitais anotada armazenadas no centro de gestão de slides digital (ou na unidade externa) usando o visualizador de slides digital. Ver a imagem do bloco dador e lado-a-lado da corrediça digital. </li><li> Selecione os pontos de referência na imagem do bloco de sobrepor a imagem do bloco de doadores com o slide digitais </li><li> Após clicar em &quot;Next&quot;, observe as anotações em uma imagem maior do bloco. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Clique em cima das anotações para confirmar e clique em &quot;Start&quot;. NOTA: Este pede ao microarrayer tecido para iniciar a perfuração de um buraco de 0,6 mm de diâmetro no bloco receptor no ponto de partida selecionado. Em seguida, num segundo passo, utilizando-se a ferramenta de perfuração, o instrumento perfura buraco no tecido do bloco dador seleccionado na região exacta anotada e confirmado. Cores são, então, transferidos do doador para o bloco receptor. </li><li> Após cerca de 500 núcleos, limpe a ferramenta de perfuração e perfuração com um cotonete de xileno. </li><li> Se núcleos de tecido são desejados (em vez de socos em um ngTMA), clique na ferramenta &quot;PCR&quot; para o bloco, confirmar até 4 anotações e clique em &quot;Iniciar&quot;. Isto vai perfurar e transferir os núcleos dentro de um tubo de 0,2 ml. </li><li> Repita ponto 4,9-4,11 com o segundo bloco dador, e assim por diante. </li><li> Depois de usar todos os blocos doadores, insira uma segunda rodada de blocos doadores (61-120) no tissue microarrayer e continuar passos 4,8-4,11. </li><li> Atualizar doadores e bloco receptor de imagens, enquanto o progresso do projeto durante a perfuração e perfuração está ocorrendo (Figura 5C). </li><li> Executar uma &quot;Export&quot;, após a conclusão do projeto. Localize o arquivo .xslx com os IDs dos doadores e bloco receptor, a localização de todos os socos dentro da TMA, bem como o layout TMA / design, na pasta exportada. Salvar todas as imagens do bloco de doadores com todo anotação sobreposta como imagens jpg na pasta exportado (Figura 5D). O bloco final TMA está então pronto. </li></ol>

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The authors have no disclosures

Neste trabalho, um protocolo para ngTMA está delineado. ngTMA é um conceito recém-criado para microarraying tecido que envolve planejamento e design, patologia digital e anotação de slides, bem como automatizado microarraying tecido 12. Comparado com microarraying tecido convencional, ngTMA oferece muitas vantagens. Em uma primeira etapa, a fase de planejamento e projeto é fundamental. O foco está em responder a uma pergunta de pesquisa orientada. Isso deve levar em consideração as questões histológicos (por exemplo, quais as regiões e quantos pontos eu quero incluir?), O planejamento estatístico (por exemplo, tamanho da amostra? Como posso analisar minhas amostras mais tarde?) E considerações logísticas (por exemplo, como muitos biomarcadores e, portanto, o número de cópias ngTMA?). A ngTMA específica é feita para as necessidades específicas, seja para a triagem de biomarcadores e de alto rendimento ou destinado a estudar os aspectos histológicos específicos em apenas alguns cas bem selecionadoses. Um deles, se não a, a desvantagem mais importante de microarraying tecido convencional é a baixa precisão com que marcas nas lâminas histológicas são feitas. O estudo das estruturas histológicas, células ou regiões específicas é feito quase impossível. ngTMA permite alta precisão porque as anotações são colocados diretamente nos slides digitais. Isso permite que o pesquisador para selecionar precisamente as regiões a serem perfurados, incluindo células específicas. Neste exemplo, várias áreas dentro do mesmo bloco de tecido são perfurados para fora para arraying, tais como o centro de tumor, frente à invasão e áreas de interação tumor / estroma com destaque para a presença de aglomerados de células tumorais pequenas ou até mesmo uma única célula. Esta precisão só pode ser conseguido usando ngTMA. Em terceiro lugar, porque as lâminas são digitalizadas em uma plataforma digital com base na Web, deslize visualização e anotações podem ser feitas através do computador, em vez de com o microscópio. O software arraying tecido proporciona uma fácil utilizaçãode interface com um elevado grau de flexibilidade, por conseguinte, diferentes disposições de concepção e ngTMA pode ser alcançado. Desde TMA construção é realizada automaticamente por perfuração, há pouca necessidade de se significativamente reduzida prática de manobra e a quantidade de tempo para a construção. O tempo para a construção do TMA, neste exemplo, é aqui entre 24 hr. Usando uma abordagem TMA convencional e estimativa de 15 golpes por hr, o projeto levaria cerca de 304 horas. ngTMA pode ser aplicado para estudar a expressão de proteínas, o ARNm ou o ADN, bem como combinações destes. Figura 9 ilustra várias destas aplicações para biomarcadores potenciais. Imunohistoquímica padrão podem ser aplicados para determinar o índice de proliferação de cancros utilizando Ki-67. Uma abordagem combinada para investigar a expressão da proteína e a amplificação do ADN por genes, tais como HER2 pode ser utilizado. Os tecidos podem ser reunidos em um único ngTMA para reduzir custos, uso de tecido e outros recursoss. Além disso, o ARNm cromogénico de hibridização in situ para HER2 e outros genes podem ser realizadas para identificar transcritos de mRNA individuais em um grande número de casos, utilizando um número mínimo de lâminas de tecido. A imuno-histoquímica de marcadores imunológicos, tais como CD8 pode ser visualizado no contexto do microambiente do tumor. Imunohistoquímica dupla também pode ser usado para realçar determinadas regiões de interesse, como as interações entre células do sistema imunológico (marcadas em vermelho) e células tumorais (marcadas em marrom) na frente de invasão de cânceres. Tal região de interesse não poderia ter sido capturado usando microarraying tecido convencional. No entanto, este protocolo contém algumas limitações. O desafio mais importante é a sobreposição entre o bloco de doadores e de slides digital. Vários fatores podem influenciar esta etapa. Em primeiro lugar, o mais tardar a partir da secção de bloqueio deve ser usado para a digitalização de slides. Em muitos casos, a H &amp; E não é a última parte do bloco dador, rather é uma coloração imuno-histoquímica ou outras. Neste caso, também uma lâmina corada pode ser usada, desde que a última mancha é digitalizado e anotada ou um novo H &amp; E deve ser feito. Cuidados também devem ser tomados quando se secções de tecido estão sendo feitas como tecidos podem expandir-se no banho de água que leva a correspondência de um desafio de slides e bloco. Em segundo lugar, no momento em que projectos estão limitados a 12 receptores de blocos TMA transformados em uma única vez. Projetos maiores superiores a 12 TMAs deve ser atribuído a um segundo nome do projeto. Em terceiro lugar, os blocos doadores devem ser feitas a partir de moldes padrão e cassetes como o instrumento não pode ajustar-se a vários tamanhos. Finalmente, blocos dadores deve exceder a altura mínima (4 mm) para conseguir a perfuração óptima. Em alguns casos, isto requer reencaixe dos tecidos. Centenas de publicações ao longo dos últimos anos destacam a TMA como uma ferramenta de valor inestimável para a pesquisa de biomarcadores. TMA foram usadas para estudar 13 pulmão, colo-rectal 7, breast 14, 15 próstata, pâncreas, 16, 17 da bexiga, e cancros gástricos 18, para citar alguns. Um número crescente de autores combinaram o uso do TMA com a análise de imagens e avanços significativos estão sendo feitos nessa direção 19-21. No entanto, ao lado de um punhado de grupos de pesquisa que tenham publicado idéias inovadoras TMA 22-24, tem sido dada pouca atenção para otimizar a técnica de TMA-se. Microarrayers tecido automatizadas, como o ATA-27 por Estigen / Beecher fornecem projeto de layout e socos tecido expediente e automatizado. Isto representa no entanto apenas um aspecto do conceito ngTMA. ngTMA é uma melhoria substancial em relação às técnicas convencionais microarraying tecido. Ele incorpora experiência em histologia e design TMA com a flexibilidade de patologia digital ea precisão de anotações digitais com a velocidade ea confiabilidade de construção automatizada TMA. A combinação de ngTMA análise da imagem e para a avaliação de proteína e moleculares biomarcadores será uma ferramenta poderosa para melhorar ainda mais a qualidade da investigação clínica e de translação no futuro.

Ao longo das duas últimas décadas, tissue microarray (TMAs) tiveram um impacto notável sobre estudos de investigação de biomarcadores. TMA são essencialmente de tecido &quot;armazenamento&quot; produzidos pela transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido, tipicamente variando em tamanho de 0,6 a 2,0 mm de diâmetro, a partir de blocos de parafina &quot;dadores&quot; num único bloco de TMA &quot;receptor&quot; (Figura 1) 1. Usando um pequeno tamanho do núcleo, aproximadamente 500 diferentes pontos de tecido de poucos ou muitos pacientes diferentes podem ser dispostos em uma TMA 2. A utilização de TMA para estudos de biomarcadores preditivos de prognóstico ou tem muitas vantagens. Considere o exemplo em que a expressão de uma proteína biomarcador por imuno-histoquímica é para ser avaliada em 450 pacientes. Em vez de executar 450 imunohistoquímica em 450 pacientes lâminas seccionadas a partir do mesmo número de blocos, pequenos núcleos de cada uma das amostras pode ser dispostos em uma única TBloco MA. Mesmo que vários núcleos são retiradas de cada paciente individual, um número mínimo de blocos são produzidos. Isso tem o efeito de diminuir considerável drasticamente os custos e outros recursos, bem como reduzir o desperdício de tecido. Além disso, este estudo permite apropriadamente alimentado usando um grande número de tecidos, a ser avaliada sob as mesmas condições experimentais. TMAs ter muitas aplicações diferentes. Por exemplo, eles podem ser usados ​​para estudar a morfologia, a expressão da proteína, a expressão de ARN e as aberrações de DNA após coloração com corantes diferentes, ou após a imuno-histoquímica, ou mesmo cromogénico e hibridação in situ fluorescente 3-7. Estudos recentes também têm utilizado TMAs para testar a variação intra e interlaboratorial em protocolos de coloração, estabelecer especificidade ou sensibilidade de anticorpos para as mutações genéticas específicas, e para determinar a reprodutibilidade interobservador da expressão da proteína em colaborações internacionais <sup&gt; 8-11. A construção de TMAs tradicional usando tecidos derivados do paciente é um procedimento passo múltiplos de comprimento (Figura 2). Ele começa com uma busca de possíveis casos adequados e seleção de lâminas de diagnóstico dos arquivos em um instituto de patologia, ou outro instituto, de onde são recuperados. O patologista avalia cada slide por caso e seleciona o slide mais representativo para os objetivos do estudo. Em seguida, a região de interesse é marcado usando uma caneta directamente sob o microscópio. Isso é muitas vezes difícil e imprecisa e resulta apenas em uma &quot;estimativa&quot; de onde socos tecido deverão ser tomadas a partir. Em seguida, os blocos de parafina correspondentes a esses slides marcados são recuperadas a partir do arquivo. Uma rápida comparação entre o bloco e slide é feito. Usando um arrayer semi-automatizada ou caseiro tecido, o bloco dador é perfurado na região estimativa de interesse e transferido para um recipiente de blocos TMA. Construção de TMAs usando esta técnica arraying é trabalhoso, demorado e impreciso, e inflexível. Preparando uma TMA de 475 pontos em 3 exemplares é estimada em cerca de 84 horas de trabalho. Uma nova abordagem para a construção de TMA foi introduzido recentemente pelo Instituto de Patologia da Universidade de Berna, que se baseia em três componentes: planejamento e projeto (ou consultoria), patologia digitais combinados com experiência em histologia e TMA automatizado arraying 12. Juntos, este conceito é chamado de próxima geração Tissue Microarray (ngTMA). Abaixo, um protocolo para ngTMA é descrita com base em um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aqui, os tumores primários, bem como metástases de linfonodos e metástases hepáticas devem ser dispostas em ngTMAs para análise de biomarcadores subseqüente. Adicionalmente, pequenos núcleos de tecido de cada paciente são desejáveis ​​para a extracção de ácido nucleico futuro.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

Pesquisa com biomarcadores depende de tissue microarray (TMA). TMA são produzidos por transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido a partir de um bloco de &quot;dador&quot; em um bloco de &quot;destinatário&quot; e, em seguida, utilizados para uma variedade de aplicações de biomarcadores. A construção de TMA convencional é de trabalho intensivo, impreciso e demorado. Aqui, um protocolo utilizando tissue microarrays de próxima geração (ngTMA) é descrito. ngTMA é baseada em planejamento TMA e design, patologia digital e microarraying tecido automatizado. O protocolo é ilustrada com um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aspectos histológicos, estatísticos e logísticos são consideradas, tais como o tipo de tecido, as regiões histológicos específicos, e os tipos de células para a inclusão na TMA, o número de pontos de tecido, tamanho da amostra, a análise estatística, e número de cópias de TMA. Lâminas histológicas para cada paciente são digitalizados e enviados para uma plataforma digital com base na web. Lá, eles são vistos e annotated (marcado) usando uma ferramenta de diâmetro 0,6-2,0 mm, várias vezes usando várias cores para distinguir áreas de tecidos. Blocos doadores e 12 blocos de &quot;destinatário&quot; são carregados no instrumento. Diapositivos digitais são recuperadas e combinadas a imagens de blocos de doadores. Arraying repetida de regiões anotados é executada automaticamente, resultando em um ngTMA. Neste exemplo, seis ngTMAs são planejadas com seis diferentes tipos de tecidos / zonas histológicas. São desejados Dois exemplares dos ngTMAs. Três a quatro lâminas para cada paciente são verificados; 3 corridas de verificação são necessárias e realizado durante a noite. Todas as lâminas são anotadas; cores diferentes são usadas para representar os diferentes tecidos / zonas, ou seja, o centro do tumor, invasão frente, tumor / estroma, metástases em linfonodos, metástases hepáticas e tecido normal. 17 anotações / case são feitas; tempo para anotação é de 2-3 min / case. 12 ngTMAs são produzidos contendo 4.556 pontos. Tempo arraying é de 15-20 horas. Devido à sua precisão, flexibilidade e de velocidade, é um poderoso ngTMAFerramenta para melhorar ainda mais a qualidade de TMA utilizado na investigação clínica e de translação.

Planejamento e Desenho Aqui foi utilizado o exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático que estão sendo investigados por uma série particular de biomarcadores. Não só é um ngTMA planejado para estes pacientes, mas a extração de DNA, seguida de análise mutacional por algum gene específico. Durante a fase de planejamento e projeto de ngTMA, os seguintes aspectos foram decididos. De cada paciente, 6 regiões histológicas diferentes serão investigadas: Centro de tumor, frente de invasão tumoral, as áreas de maior densidade tumor brotamento (interação tumor / estroma), o tecido normal, metástases linfáticas e metástases hepáticas. Três pontos de tumor por área de tecido tumoral e dois pontos de tecido normal devem ser incluídos no projeto (n = 17 pontos por paciente). Uma vez que está previsto que mais de 50 biomarcadores ser investigado neste material do paciente, são desejadas duas cópias do ngTMA final. Devido à possibilidade de pequeno tamanho de linfonodos e distanmetástases t, um pequeno diâmetro do núcleo de 0,6 mm para TMA construção para todos os tecidos é escolhido. Além disso, está previsto que cada região se vestisse separadamente, de modo que 6 ngTMAs contendo diferentes áreas histológicas serão produzidos: um ngTMA contendo tecidos do centro do tumor a), b) frente invasão, áreas c) tumor brotamento, d) o tecido normal , e) de metástases linfáticas, e f) metástases hepáticas. Para a concepção do TMA usando uma ferramenta de 0,6 milímetros, uma distância confortável de 0,4 milímetros entre perfuradores será seleccionado. Porque a avaliação de manchas de tecidos em linhas e colunas longas muitas vezes é cansativo, dois projetos diferentes são selecionados. Para os blocos tumorais com três socos por área de tecido, um projeto contendo seis partes é criado. Isto leva a um número total de 402 golpes de tecido. Para socos tecido normal, dois socos por caso devem ser incluídos. Um layout de montagem 432 socos no total é escolhida. Além disso, para cada caso, até 4núcleos de 0,6 milímetros, adicionalmente, ser perfurado e colocado em tubos de 0,2 ml. Estes núcleos de tecido também será anotada. Para resumir, 6 ngTMAs de diferentes tecidos serão produzidos (5 séries de tumores x 3 socos x 134 pacientes; uma matriz tecido normal x 2 socos x 134 pacientes), além de quatro núcleos por paciente para tubos. Tomados em conjunto, 2.814 anotações serão feitas. Em seguida, as lâminas correspondentes H &amp; E de pacientes selecionados serão recuperadas a partir do arquivo de slides. Cada caso é brevemente revisto por um patologista ea maioria das lâminas representativas de cada tipo de tecido são selecionados. Digitalização Lâminas digitais de cada corte histológico são feitas para anotação futuro. Para este estudo, 3-4 lâminas de tecido deverão ser digitalizados por caso, ou seja, o câncer colorretal primário, com ou sem os tecidos normais adjacentes, metástases em linfonodos e metástases hepáticas e, possivelmente, um slide de con adicionaltenção mucosa normal. Até 10 revistas diferentes pode ser totalmente carregada no scanner de slides; portanto, 250 slides podem ser digitalizados em um único prazo. Tempo para a digitalização e tamanho do diapositivo digitais varia de acordo com as dimensões do tecido e o factor de qualidade desejada. As faixas de fator de qualidade de 0 a 100 Aqui, um fator de qualidade de 60 é selecionado, uma vez que produz um tamanho de arquivo de digitalização menor sem perda perceptível de qualidade da digitalização. Pequenas biópsias podem ser digitalizados em menos de 30 segundos, enquanto cortes de tecido inteiro, como os usados ​​neste exemplo pode demorar entre 2 e 10 min. Tamanho do slide Digital também pode variar de 2 MB a 2 GB. Usando um fator de qualidade de 60, verifica entre 600 MB e 1 GB são produzidos. Entre 402 e 536 lâminas são necessários para este projeto, totalizando 3 séries de digitalização. Cada etapa é realizada durante a noite. Cerca de 500 GB de espaço de armazenamento é necessário. Slides são digitalizados diretamente para uma plataforma digital chamado Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center é acessível de qualquer lugar com acesso à web, inserindo o nome de usuário e senha designado. Anotação Para anotação, dois aspectos devem ser considerados: 1) diferentes áreas do tecido deve ser dada diferentes cores de anotação e 2) o número de anotações deve refletir o número de cópias desejadas do ngTMA final. Neste caso, três pontos por área de tumor para uma única cópia foram selecionados. Para 2 cópias, cada região deve ser anotada com 6 pontos. Útil é verde para o tecido normal, azul para o centro de tumor, amarelo para a frente de invasão tumoral, vermelho para as áreas de tumor de brotamento (tumor / estroma) interação, preto de metástases linfáticas, turquesa para metástases à distância e finalmente branco para regiões de ser utilizado para os tubos. Anotação de cada caso requer 2-3 min. Construção ngTMA Este estudo requer 6 ngTMA blocos to ser construída em duas cópias, resultando em 12 blocos finais. O número máximo de blocos receptores que pode ser suportado pela arrayer é 12 Cada bloco de tumor irá conter 402 pontos de tecido e cada bloco de tecido normal conterá 268 pontos, totalizando 4.556 pontos em todo o projeto. Um layout TMA é criada para cada bloco receptor eo projeto está salvo (Figuras 6A, 6B). 60 os blocos de tecido pode ser carregado no microarrayer tecido em paralelo; uma imagem de cada bloco dador é feita. Começando com o primeiro bloco de doadores, o slide digitais anotada correspondente é recuperada do processo Center. Correspondência de slides é realizada, o que pode demorar entre 1-3 min. As anotações são confirmadas ea arrayer é solicitado para iniciar perfuração (Figura 7). Perfuração e tempo de transferência de núcleo é de aproximadamente 12 segundos. Perda de núcleos durante este procedimento é mínimo. O tempo total para arraying este projeto é de aproximadamente 24 horas, incluindo o tempo para SLIde / bloco de correspondência e recarga do instrumento. Alguns exemplos de ngTMA estão ilustrados na Figura 8A. Núcleos para análise molecular subsequente também pode ser perfurado no momento (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A) Um bloco &#39;doador&#39;. Cores do bloco doador são perfurados para fora e transferido para B) um bloco receptor, ou tissue microarray (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 O fluxo de trabalho de tissue microarray convencional. A) lâminas histológicas são recuperadas a partir do arquivo e B) dada ao patologista f<html> ou revisão. CD) As anotações são feitas nos slides que indicam a região estimada &#39;para transferência. E) Os blocos de tecido correspondentes são recuperadas. F) Block e slides são comparados para correspondência, o que pode G), por vezes, ser uma tarefa desafiadora. HJ ) microarraying Tissue toma então lugar. K) Cores são repetidamente transferidos e L) uma TMA final é construído. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 a) até 25 lâminas podem ser colocados em cada revista para digitalização. B) Ajustes para o fator de qualidade e tamanho pode ser feito. Progresso da digitalização pode ser monitorado. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4 A) Digitalizado slides podem ser transferidos para a plataforma baseada em web, Caso Center. B) lâminas digitais podem ser vistos. A ferramenta de anotação TMA permite ao usuário selecionar o tamanho do núcleo e cor necessária para anotação. C) As anotações podem ser colocados diretamente sobre a lâmina digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 A) Até 60 blocos podem carregado no microarrayer tecido, ou seja, 10 blocos doadores por linha e 12 destinatários blocos também. B) Uma imagem de cada bloco doador é retirado, a digital slide é recuperado. Correspondência de bloco de corrediça e é feito e anotações são utilizadas para bloquear a perfuração. C) O progresso da arraying pode ser monitorizada, enquanto o instrumento está perfurando. D) Após a perfuração é executada, a exportação da localização de cada ponto no esquema mas também uma imagem de cada bloco dador com anotações correspondentes é feita. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Estes layouts TMA foram utilizados para predispor os blocos de tumor A) e B) os tecidos normais. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Tela do software microarrayer tecido. À esquerda, 12 recipient blocos pode ser colocada no instrumento. Na parte inferior, são tomadas as imagens de cada bloco dador. No centro, o layout do TMA, o progresso da perfuração, bem como as imagens ampliadas de cada bloco dador com anotações é encontrado. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8 A) Alguns exemplos de blocos ngTMA recém-criados. B) socos tecido adicionais podem ser tomadas para análise molecular subseqüente. Estes núcleos são perfurados e colocado em tubos de 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9 Exemplos de aplicações de biomarcadores ngTMA. A) Imunohistoquímica coloração de Ki67 em câncer colorretal. Dupla HER2 imunohistoquímica / hibridação in situ, ensaio mostrando B) a baixa expressão da proteína (castanho) e nenhuma amplificação do gene Her2 (preto) em relação ao centrómero (vermelho), C), de expressão elevada de proteína (castanho) e a amplificação do gene Her2 ( preto) em relação ao centrómero (vermelho). D) Hibridização in situ de Her2 que mostra transcritos de ARNm únicos no cancro da mama ngTMA. E) Imuno-histoquímica para CD8 no câncer colorretal. F) Duplo mancha imunohistoquímica para marcador pan-citoqueratina AE1 / AE3 (marrom; células tumorais) e CD68 (vermelho;. Macrófagos) destacando microambiente do tumor no câncer colorretal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado.

A próxima geração de tissue microarray (ngTMA) Protocolo de Estudos biomarcadores

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K visualizações.  University of Bern.  O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado. 

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Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Construção Manual de uma Microarray de Tecido usando o Método de Fita e um Microarrayer Portátil

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Pesquisa do câncer

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Bioengenharia

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

Imunologia e Infecção

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Biologia

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

Modelagem imunológica preditiva de tumores sólidos

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...