Agradecemos às pessoas que doaram seus corpos para o avanço da educação e da pesquisa. Somos gratos à Fundação OneLegacy, que formou a base para a obtenção de corações de doadores para pesquisa. Também somos gratos a Anthony A. Smithson e Arvin Roque-Verdeflor, do Centro de Imagens de Pesquisa Translacional da UCLA (Departamento de Radiologia), por seu apoio na aquisição de dados de TC. Este projeto foi apoiado pelo Projeto UCLA Amara Yad. Somos gratos aos Drs. Kalyanam Shivkumar e Olujimi A. Ajijola por estabelecer e manter um pipeline do coração humano para pesquisa. Agradecemos à nossa Gerente de Operações de Pesquisa, Amiksha S. Gandhi, por sua dedicação em apoiar nossos projetos. Este trabalho foi possível graças ao apoio das bolsas do NIH OT2OD023848 & P01 HL164311 e Leducq 23CVD04 para Kalyanam Shivkumar, o Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da American Heart Association 23CDA1039446 para PH e o Projeto UCLA Amara-Yad (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). O scanner GNEXT microPET/CT usado neste estudo foi financiado por uma bolsa de instrumentação compartilhada do NIH para pesquisa animal (1 S10 OD026917-01A1).

Este estudo usou amostras de tecido não identificadas coletadas de corações humanos de doadores sem falha e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). As amostras foram obtidas de corações sem falha que foram rejeitados para transplante. Os corações foram perfundidos por pressão, fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) e fotografados antes do processamento do tecido pelos seguintes métodos. A Figura 1 resume o fluxograma da ordem do estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Exame em microescala
<ol><li>Limpeza de tecido usando imagem 3D habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente (iDISCO+) protocolo.<ol><li>Disseque o tecido fixado com PFA a 4% com um bisturi para caber na câmara de 3 mm × 16 mm × 25 mm para microscopia confocal. Para obter imagens de tecidos mais espessos, câmaras e/ou espaçadores adicionais podem ser empilhados na lâmina.</li>
		<li>Desidratar amostras usando séries graduadas de metanol (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% e 100% MeOH em H2O deionizado [vol/vol]) por 1 h cada à temperatura ambiente (RT) com agitação.</li>
		<li>Lave com 100% MeOH por 1 h em RT e mergulhe em 66% de diclorometano/33% de MeOH em RT com agitação durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte, lave duas vezes em MeOH (100%) por 1 h em RT, leve à geladeira a 4 ° C e trate com 5% H2O2 em MeOH (vol / vol) durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Reidrate com séries graduadas de MeOH (80%, 60%, 40% e 20% de MeOH) e lave em 0,01 mol/L PBS por 1 h cada em RT com agitação.</li>
		<li>Lave os tecidos duas vezes em 0,01 mol / L PBS com 0,2% de Triton X-100 por 1 h em RT.</li>
		<li>Prepare-se para a imunomarcação permeabilizando em PBS 0,01 mol/L, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,2% de Triton X-100 e 0,3 mol/L de glicina por 2 dias a 37 °C com agitação.</li>
		<li>Bloqueie em PBS 0.01 mol/L com 10% de DMSO, 0.2% de Triton X-100 e 5% de soro de burro normal por mais 2 dias a 37 °C com agitação.</li>
		<li>Marcação com um anticorpo primário compatível com MeOH conjugado a fluoróforos diluídos em PBS 0,01 mol/L com 10 mg/mL de heparina (PTwH), Tween-20 a 0,2%, DMSO a 5% e soro de burro normal a 3% por 3-4 dias a 37 °C com agitação.</li>
		<li>Reabastecer a solução de anticorpos e incubar por mais 3-4 dias a 37 °C com agitação.</li>
		<li>Após 1 semana de incubação em solução primária de anticorpos, lave 4 a 5 vezes em PTwH durante a noite em RT.</li>
		<li>Incubar com anticorpo secundário conjugado a fluoróforos diluídos em PTwH, soro de burro normal a 3% por 3 dias a 37 °C com agitação.</li>
		<li>Reabastecer a solução de anticorpos secundários e incubar durante mais 3 dias a 37 °C com agitação.</li>
		<li>Após 6 dias de incubação em solução de anticorpos secundários, lave em PTwH 4-5 vezes durante a noite em RT.</li>
		<li>Desidratar com uma série graduada de MeOH (20%, 40%, 60%, 80%, 100% e 100% MeOH). A amostra pode ser armazenada durante a noite em RT.</li>
		<li>Incubar em diclorometano a 66% / MeOH a 33% por 3 h em RT com agitação.</li>
		<li>Lave duas vezes em diclorometano a 100% por 15 min em RT com agitação.</li>
		<li>Incubar e armazenar amostras em éter benzílico. Encha o tubo para minimizar o ar de oxidação da amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem da amostra limpa de tecido<ol><li>Fixe uma câmara contendo adesivo em uma lâmina e aplique esmalte ao redor do perímetro da câmara. Para tecidos mais espessos, câmaras e/ou espaçadores adicionais podem ser empilhados na lâmina.</li>
		<li>Coloque o tecido limpo na câmara, encha com éter benzílico e aplique uma lamínula.</li>
		<li>Aplique esmalte ao redor da lamínula para criar uma vedação.</li>
		<li>Obtenha imagens de tilescan e pilha Z usando um microscópio confocal de varredura a laser vertical com uma lente de 5x ou 10x para obter imagens em uma profundidade até a distância de trabalho da lente.</li>
		<li>Imagem com resolução de 1024 x 1024 usando linhas de laser apropriadas para espectros de emissão de fluoróforos usados. A autofluorescência muscular é visível usando a linha de laser de 488 nm.</li>
		<li>Certifique-se de que o tamanho do passo do eixo z seja compatível com a amostragem de Nyquist com base na abertura numérica da objetiva especificada11.</li>
		<li>Costure imagens e use software para visualização 3D.</li>
		<li>Crie figuras usando imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) de pilhas Z para canais individuais e mesclados (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Imuno-histoquímica NOTA: Depois que o tecido é embebido em parafina22, o procedimento a seguir é usado para criar lâminas para estudo imuno-histoquímico.<ol><li>Preparação da solução de correspondência do índice de refração (RIMS).<ol><li>Prepare o tampão fosfato 0,1 mol / L adicionando 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) e 3,1 g de NaH2PO4 (monohidratado) ao H2O deionizado a um volume total de 1 L (pH 7,4). Filtre a solução e guarde-a em RT.</li>
			<li>Dilua o tampão fosfato para 0,02 mol/L.</li>
			<li>Dissolva o Histodenz em 30 mL de tampão fosfato 0,02 mol / L agitando a solução por 10 min com uma barra de agitação magnética no frasco de armazenamento final que pode ser lacrado para minimizar a evaporação e a contaminação.</li>
			<li>Adicione azida de sódio a uma concentração total de 0,01% (p / v) e ajuste o pH para 7,5 com NaOH.</li>
			<li>Ajuste o RI variando a concentração final de Histodenz.</li>
			<li>Armazene o RIMS no RT por meses. Descarte se for observada contaminação microbiana. NOTA: NÃO autoclave nenhuma solução que contenha azida sódica.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparação de lâminas para estudo imuno-histoquímico<ol><li>Crie seções de 5 μm de espessura com micrótomo. Aplique a seção de tecido nas lâminas carregadas.</li>
			<li>Remova a parafina incubando as lâminas em xileno >75% por 10 min. Mova as lâminas para um segundo recipiente com xileno por mais 10 min.</li>
			<li>Remova o xileno imergindo as lâminas em 100% de EtOH por 10 min, depois em 95% de EtOH por 5 min e 70% de EtOH por 5 min.</li>
			<li>Enxágue as lâminas com H2O deionizado por 5 min.</li>
			<li>Mergulhe as lâminas em tampão de recuperação de antígeno por 25 min a 90-95 ° C.</li>
			<li>Deixe o recipiente esfriar até RT por 1 h com agitação.</li>
			<li>Mergulhe as lâminas em tampão de imersão (0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100) por 30 min a 4°C.</li>
			<li>Circunde o tecido com uma caneta PAP. Adicione PBS a cada lâmina e coloque-a em uma câmara umidificada para evitar a dessecação.</li>
			<li>Lave as lâminas com PBS em RT com agitação por 5 min.</li>
			<li>Bloqueie com tampão de bloqueio (0,01 mol / L PBS + 10% de soro de burro + 0,1% de TX-100) por 1 h com agitação.</li>
			<li>Incubar com um anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C.</li>
			<li>No dia seguinte, deixe os slides aquecerem até o RT por 15 min.</li>
			<li>Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 por 5 min.</li>
			<li>Incubar com um anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 1 h em RT com agitação.</li>
			<li>Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 por 5 min.</li>
			<li>Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS por 5 min.</li>
			<li>Coloque 1 gota de RIMS com um conta-gotas e aplique uma lamínula.</li>
			<li>Aplique esmalte ao redor da lamínula para criar a vedação.</li>
			<li>Como controlo negativo, executar uma amostra sem o anticorpo primário para demonstrar a ausência de coloração específica.</li>
		</ol></li>
		<li>Lâminas imunocoradas por imagem<ol><li>Visualize as lâminas com um microscópio confocal de varredura a laser com lentes objetivas de 10x, 20x e 40x.</li>
			<li>Imagem com resolução de 1024 x 1024 usando linhas de laser apropriadas para os espectros de emissão dos anticorpos secundários usados.</li>
			<li>Crie figuras usando imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) de pilhas Z para canais individuais e mesclados (Figura 3).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Exame em mesoescala
<ol><li>Dissecção estereoscópica<ol><li>Realize dissecções delicadas com foco em estruturas minúsculas ou finas, como nó atrioventricular, artéria do nó atrioventricular e plexo nervoso cardíaco (escala submilimétrica a milimétrica) com uma lâmpada de mesa de aumento com pinça, telescópios cirúrgicos ou estereomicroscópio.</li>
	</ol></li>
	<li>Microtomografia computadorizada NOTA: A tomografia computadorizada é realizada após perfusão e fixação por pressão e em qualquer estágio da dissecção usando uma tomografia por emissão de micropósitrons (PET)/tomografia computadorizada (Figura 4).<ol><li>Aqueça a fonte de raios-X da TC por 25 minutos antes da imagem da amostra.</li>
		<li>Coloque a amostra de coração na base do scanner.</li>
		<li>Mova a base do scanner para uma posição horizontal de 544 mm e uma posição vertical de 14 mm para centralizar o coração no campo de visão (FOV) da TC.</li>
		<li>Adquira a imagem de TC a 80 kVp, 150 μA, com 720 projeções durante o tempo de varredura de 1 minuto a uma resolução espacial de 200 μm.</li>
		<li>Reconstrua os dados de TC com um campo de visão de 12 cm x 12 cm x 10 cm e uma matriz de 600 x 600 x 500 voxels e salve como um arquivo DICOM.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Exame em escala macro
<ol><li>Perfusão e fixação por pressão NOTA: Os autores modificam as técnicas de perfusão e fixação por pressão descritas anteriormente e as aplicam aos corações humanos sem falha rejeitados para transplante 14,19,20,21.<ol><li>Use bombas de alto fluxo para fixação de perfusão. Use 100% de etanol14, 4% de PFA ou 10% de formalina para o fixador. NOTA: O coração é recuperado com a aorta ascendente, o tronco pulmonar e ambas as veias cavas e as veias pulmonares ressecadas o mais distalmente possível e entregues na solução23 da Universidade de Wisconsin.</li>
		<li>Use duas cânulas cirúrgicas 20-24 Fr para perfusão cardíaca direita e esquerda. Para perfusão cardíaca direita, canule a veia cava superior e coloque uma ventilação no tronco pulmonar ou na artéria pulmonar com seringas plásticas de 12 a 30 mL cortadas pela metade com pontas Luer-Lock presas a torneiras de três vias.</li>
		<li>Oclua a veia cava inferior e a outra artéria pulmonar com barbante depois de colocar uma seringa de plástico meio cortada de tamanho apropriado ou tubo de centrífuga de 1,5-5,0 mL.<ol><li>Para perfusão anterógrada do coração esquerdo, canule uma das veias pulmonares e coloque uma abertura na extremidade distal cortada da aorta com as seringas plásticas de 12 a 30 mL meio cortadas com pontas Luer-Lock presas a torneiras de três vias.</li>
			<li>Para a perfusão retrógrada do coração esquerdo, canule um dos ramos do arco aórtico e coloque uma abertura em outro ramo do arco aórtico. Coloque as pontas das cânulas em ambos os ventrículos.</li>
		</ol></li>
		<li>Ocluir outros orifícios do recipiente com barbante depois de inserir uma seringa de plástico meio cortada de tamanho apropriado ou um tubo de microcentrífuga de 1,5-5,0 mL. Use uma gaze fina para cobrir a parte de inserção das seringas/tubos/cânulas para evitar vazamentos e deslizamentos. Corrija grandes vazamentos usando sutura, bandagem ou aglomeração. Pequenos vazamentos são permitidos.</li>
		<li>Suspenda o coração em um recipiente de plástico.</li>
		<li>Conecte o tubo de plástico macio 22-24 Fr a cada cânula e insira a outra extremidade do tubo no recipiente cheio de fixador.</li>
		<li>Circule o fixador pelos circuitos do coração direito e esquerdo usando uma bomba de alto fluxo ajustada em aproximadamente 100-300 mL / min para o coração direito e 200-400 mL / min para o coração esquerdo para atingir aproximadamente 20 mmHg no ventrículo direito e 80 mmHg no ventrículo esquerdo, respectivamente.</li>
		<li>Manter a perfusão a 4 °C durante 24 h.</li>
		<li>Lave o coração com 0,01 mol / L PBS por 30 min com agitação quatro vezes.</li>
		<li>Armazene o coração em 0,01 mol / L PBS / 0,02% de azida de sódio a 4 ° C. NOTA: A fixação por pressão-perfusão só é eficaz para um coração fresco, não para um coração recuperado de um cadáver embalsamado.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção macroscópica<ol><li>Realize a dissecção progressiva com registros fotográficos em cada estágio da dissecação.</li>
		<li>Para manter a relevância clínica, preste atenção especial para evitar distorcer/deformar quaisquer estruturas para manter a morfologia fisiológica do coração.</li>
		<li>Estruturas alvo de imagens usando orientação clinicamente relevante, como orientação oblíqua anterior direita.</li>
	</ol></li>
	<li>Fotografia<ol><li>Coloque o coração fixo e perfundido sob pressão em um tripé com uma plataforma montada com vários pinos e a capacidade de girar 360o.</li>
		<li>Fotografe o coração usando uma câmera reflex digital de lente única (Figura 5)24 enquanto usa vários painéis de luz de diodo emissor de luz colocados nos suportes C e um amplo pano de fundo preto de edredom.</li>
		<li>Fotografe usando a lente com uma distância focal longa (200 mm) para uma distância de trabalho de 4-6 pés para minimizar a distorção do assunto14.</li>
	</ol></li>
	<li>Anaglyphs<ol><li>Para exibir imagens anaglíficas, reconstrua um par de fotografias ou imagens renderizadas em volume a partir de conjuntos de dados de TC com uma diferença de 10° no ângulo de rotação no plano horizontal.</li>
		<li>Converta um conjunto dessas imagens bidimensionais (2D), chamadas de estereograma, em anáglifos usando freeware16.</li>
		<li>Para visualizar um anáglifo, use óculos vermelhos/cianos.</li>
	</ol></li>
	<li>Fotogrametria NOTA: A fotogrametria é a ciência aplicada de gerar uma reconstrução tridimensional renderizada na superfície a partir de várias fotografias bidimensionais tiradas em ângulos variados17.<ol><li>Suspenda a amostra em C-Stands ou coloque-a na mesa giratória para obter centenas de fotografias multidirecionais com um smartphone.</li>
		<li>Gere o modelo 3D no formato FBX usando software disponível comercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografia computadorizada (TC) NOTA: A tomografia computadorizada pode ser realizada após perfusão e fixação por pressão e em qualquer estágio da dissecção.<ol><li>Suspenda a amostra de coração de uma barra colocada na parte superior do recipiente. Para evitar que o coração balance durante o exame, apoie a base do coração com pinos de plástico fixados no fundo do recipiente. Assim, o ar servirá como um contraste negativo.</li>
		<li>Realize a tomografia computadorizada usando um tomógrafo de linha multidetectores disponível comercialmente com os seguintes parâmetros: tensão do tubo de 120 kV, corrente do tubo de 800-900 mA e rotação do pórtico de 280 ms. O produto de duração da dose é geralmente 500-1200 mGy.cm.</li>
		<li>Reconstrua os dados da imagem axial usando os seguintes parâmetros: uma espessura de seção, 0,6 mm; um intervalo incremental, 0,3 mm; um campo de visão, o menor possível (geralmente 100-200 mm); e uma matriz, 512 × 512.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecação virtual<ol><li>Analise as imagens de tomografia computadorizada usando software disponível comercialmente para gerar imagens de dissecção virtual. NOTA: A dissecção virtual é uma modificação do processo de renderização de volume em que o foco é deslocado para as paredes das câmaras e vasos cardíacos18. Nesse processo, o limite manual praticamente remove a câmara aprimorada dos conjuntos de dados originais.</li>
		<li>Visualize as paredes, septos e válvulas sem realce com dissecção virtual para produzir imagens semelhantes à dissecção macroscópica. Ao contrário da dissecção macroscópica das amostras cardíacas, os planos de corte durante a dissecção virtual são praticamente ilimitados. Quase qualquer visualização pode ser recriada para visualizar as estruturas de interesse conforme necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Impressão 3D<ol><li>Abra o arquivo compatível da amostra de coração no software da impressora 3D.</li>
		<li>Use o perfil de 0,10 mm Fast DETAIL para as configurações de impressão na impressora 3D e reduza a velocidade de impressão para 20 mm/s. Ative Gerar material de suporte.</li>
		<li>Use o perfil de filamento TPU para "Configurações de filamento" na impressora 3D.</li>
		<li>Use o profile do bocal Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 para "Configurações da impressora" na impressora.</li>
		<li>Após a conclusão do fatiamento, salve o arquivo BGCODE em uma unidade flash USB para impressão 3D.</li>
		<li>Use o filamento TPU de 1,75 mm para imprimir em 3D a amostra do coração humano. Antes da impressão 3D, secar o filamento TPU durante 6 h com um secador de filamentos.</li>
		<li>Para reduzir a tensão do filamento durante a impressão 3D, coloque o carretel de filamento em um suporte de carretel com um rolamento embutido para facilitar a rotação do carretel de filamento. Realize a impressão 3D usando uma impressora 3D disponível comercialmente com uma chapa de aço revestida a pó texturizada.</li>
		<li>Remova cuidadosamente os materiais de suporte quando a impressão 3D estiver concluída.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análise 3D abrangente de corações humanos de micro a macro escalas

<ol>
	<li>Tawara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+reizleitungssystem+des+s&#228;ugetierherzens.+Eine+anatomisch-histologische+studie+&#252;ber+das+atrioventrikularb&#252;ndel+und+die+purkinjeschen+f&#228;den.">Das reizleitungssystem des s&#228;ugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie &#252;ber das atrioventrikularb&#252;ndel und die purkinjeschen f&#228;den.</a> Jena: Gustav fischer. , (1906).</li><li>Stephenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3-dimensional+imaging+of+the+human+cardiac+conduction+system+from+microanatomy+to+mathematical+modeling.">High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling.</a> Sci Rep. 7 (1), 7188 (2017).</li><li>Kawashima, T., Sato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+in+situ+3D+visualization+of+the+human+cardiac+conduction+system+and+its+transformation+associated+with+heart+contour+and+inclination.">First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination.</a> Sci Rep. 11 (1), 8636 (2021).</li><li>Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+demonstration+of+cholinesterase-containing+nerves+in+the+right+atrial+wall,+nodal+tissue,+and+atrioventricular+bundle+of+the+pig+heart.">Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart.</a> J Anat. 108, 375-386 (1971).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglionated+plexi+and+ligament+of+marshall+ablation+reduces+atrial+vulnerability+and+causes+stellate+ganglion+remodeling+in+ambulatory+dogs.">Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs.</a> Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).</li><li>Chung, W. 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Wallace a. Mcalpine.</a> Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).</li><li>Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereogram+of+the+living+heart,+lung,+and+adjacent+structures.">Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures.</a> Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).</li><li>Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photogrammetry+of+perfusion-fixed+heart:+Innovative+approach+to+study+3-dimensional+cardiac+anatomy.">Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy.</a> JACC Case Rep. 21, 101937 (2023).</li><li>Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+dissection:+Emerging+as+the+gold+standard+of+analyzing+living+heart+anatomy.">Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30 (2020).</li><li>Thomas, A. C., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+cardiac+pathology+using+perfusion-fixation.">The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation.</a> Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).</li><li>Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+pressure+fixation+apparatus+for+hearts.">Controlled pressure fixation apparatus for hearts.</a> Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).</li><li>Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visible+heart(r)+project+and+free-access+website+'atlas+of+human+cardiac+anatomy.">The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy.</a> Europace. 18, 163-172 (2016).</li><li>Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+staining+for+paraffin-embedded+lung+cancer+tissue.">Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue.</a> J Vis Exp. (201), e65850 (2023).</li><li>Tripathy, S., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+organ+preservation:+Current+prospective+and+challenges.">Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges.</a> Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+cardiac+anatomy+(anatomical+basis+of+cardiac+interventions.+Vol.+1).">Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1).</a> Cardiotext. , (2022).</li><li>Crosado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenoxyethanol-based+embalming+for+anatomy+teaching:+An+18+years'+experience+with+crosado+embalming+at+the+university+of+otago+in+new+zealand.">Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand.</a> Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).</li><li>Titmus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+creation+of+photorealistic+3d+cadaveric+models+using+photogrammetry.">A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry.</a> J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).</li><li>Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+applications+of+virtual+reality+in+cardiovascular+medicine.">Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine.</a> JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).</li><li>Maresky, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+reality+and+cardiac+anatomy:+Exploring+immersive+three-dimensional+cardiac+imaging,+a+pilot+study+in+undergraduate+medical+anatomy+education.">Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education.</a> Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+three-dimensional+cardiac+imaging+using+leading-edge+holographic+display.">Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display.</a> Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).</li></ol>

O presente estudo demonstra o pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos inteiros. Os resultados representativos mostram exames anatômicos em micro a macroescala realizados rotineiramente em um único coração. Como uma amostra de coração humano é extremamente preciosa, uma abordagem em várias escalas é ideal e eficaz para não desperdiçar nenhuma parte da amostra aplicando vários protocolos para vários fins, incluindo descoberta em pesquisa científica, melhoria de procedimentos c...

Como a função segue a forma, entender a arquitetura do coração é fundamental para a apreciação de sua fisiologia. Embora inúmeras investigações tenham revelado a anatomia cardíaca de micro a macroescalas 1,2,3, várias questões permanecem sem solução, especialmente aquelas relacionadas à anatomia cardíaca humana. Isso ocorre em parte porque os estudos básicos com foco na anatomia funcional geralmente utilizaram corações de animais 4,5,6, que muitas vezes são distintos dos corações humanos 1,7,8. Além disso, cada estudo individual, mesmo aqueles que usam amostras de coração humano, tende a se concentrar em estruturas muito específicas, o que dificulta a aplicação dos achados no contexto de todo o coração. Isso é ainda mais verdade se as estruturas focadas estiverem em micro ou mesoescalas, como o perínexo9 e os plexos ganglionares10.
Nesse contexto, o estudo estrutural sistêmico do coração humano rejeitado para transplante oferece uma oportunidade única e rara de obter um atlas abrangente das estruturas cardíacas em foco em escalas microscópicas e macroscópicas11. Os protocolos de exame microscópico incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos eliminados com solvente, iDISCO+)12,13 e coloração imuno-histoquímica. Os protocolos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica, macrofotografia e tomografia computadorizada (TC). Os protocolos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica14, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria) 15 , 16 , 17 , tomografia computadorizada , dissecção virtual18 e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro17. Na preparação para o exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão é realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração 14,19,20,21. A aplicação combinada dessas técnicas é única e crucial para correlacionar características anatômicas distintas no contexto da arquitetura 3D do coração humano.
Como a oportunidade de obter uma amostra de coração humano não patológico é extremamente limitada, uma abordagem multiescala descrita aqui maximiza o uso da amostra. Ao aplicar vários procedimentos descritos abaixo, os resultados representativos ilustrarão ao leitor como os achados podem ser utilizados para múltiplos propósitos, incluindo descoberta em pesquisa científica11 (análises abrangentes da inervação cardíaca, distribuição dos plexos ganglionares), melhoria dos procedimentos clínicos (simulação para abordagens cirúrgicas e intervencionistas) e educação anatômica (demonstração 3D real da anatomia cardíaca).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>713-605-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle - Cy3 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>139 103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm</td>
			<td>NinjaTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>Decon laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNEXT PET/CT</td>
			<td>SOFIE Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN (black edition)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Imaris 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>Sunjin Labs</td>
			<td>iSpacer 3mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIRI Engine</td>
			<td>KIRI Innovation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAD-2 - Vertical &#38; Multi-channels Peristaltic Pump</td>
			<td>LONGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightview XL&#160;</td>
			<td>Brightech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (Certified ACS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D850</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4</td>
			<td>NinjaTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa MK4 3D printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycam</td>
			<td>Polycam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrusaSlicer 2.7.1</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARA-Engine</td>
			<td>pita4 mobile LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaniverse</td>
			<td>Niantic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antiface Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>7144.8-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOMATOM Definition AS</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Field Surgi-Spec Telescopes,&#160;</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System SZ61</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoPhoto Maker</td>
			<td>Free ware developed by Masuji Suto</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziostation2</td>
			<td>Ziosoft, AMIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pipeline for multi-scale three-dimensional anatomic study of the human heart

O estudo detalhado de corações humanos sem falha rejeitados para transplante oferece uma oportunidade única de realizar análises estruturais em escalas microscópicas e macroscópicas. Essas técnicas incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente) e coloração imuno-histoquímica. Os procedimentos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica e tomografia computadorizada (TC). Os procedimentos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria), tomografia computadorizada e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro. Antes do exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão pode ser realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração. A aplicação dessas técnicas em combinação para estudar o coração humano é única e crucial para entender a relação entre características anatômicas distintas, como vasculatura coronária e inervação miocárdica, no contexto da arquitetura 3D do coração. Este protocolo descreve as metodologias em detalhes e inclui resultados representativos para ilustrar o progresso na pesquisa da anatomia cardíaca humana.

Exames em microescala A aplicação de limpeza de tecido permite a aquisição de imagens de grandes volumes de tecido em 3D usando microscopia confocal. No coração, podem ser visualizados gânglios contendo neurônios cardíacos e o padrão neural da inervação miocárdica (Figura 2). A Figura 3 mostra uma imagem confocal do miocárdio do ventrículo esquerdo humano imunomarcado para nervos e células musculares lisas. Observa-se que os v...

Autor em destaque: Avançando a anatomia cardíaca humana por meio da análise multiescala de corações

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos que abrangem as escalas microscópica e macroscópica.

Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic ...

pipeline-for-multi-scale-three-dimensional-anatomic-study-human

Research

JoVE Journal

Biology

Pipeline for Multi-Scale Three-Dimensional Anatomic Study of the Human Heart

251 visualizações.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Conhecer a anatomia cardíaca é fundamental para entender a fisiologia cardíaca. Os estudos de anatomia funcional abrangeram as escalas micro a macro, mas usaram amplamente corações de animais. O estudo sistemático de corações humanos de doadores rejeitados para transplante oferece uma oportunidade única para desenvolver um atlas abrangente que abrange as escalas microscópicas e macroscópicas.Por meio do estudo do coração humano em diferent...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando a anatomia cardíaca humana por meio da análise multiescala de corações

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabricação de Chip porte Andaimes para tridimensional de cultivo celular

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.