Wir danken den Menschen, die ihre Körper für die Förderung von Bildung und Forschung gespendet haben. Wir danken der OneLegacy Foundation, die die Grundlage für die Gewinnung von Spenderherzen für die Forschung bildete. Wir danken auch Anthony A. Smithson und Arvin Roque-Verdeflor vom UCLA Translational Research Imaging Center (Department of Radiology) für ihre Unterstützung bei der CT-Datenerfassung. Dieses Projekt wurde vom UCLA Amara Yad Project unterstützt. Wir danken Dr. Kalyanam Shivkumar und Dr. Olujimi A. Ajijola für den Aufbau und die Pflege einer Pipeline für die Forschung im menschlichen Herzen. Wir danken unserer Research Operations Managerin, Amiksha S. Gandhi, für ihr Engagement bei der Unterstützung unserer Projekte. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der NIH-Zuschüsse OT2OD023848 & P01 HL164311 und Leducq Grant 23CVD04 für Kalyanam Shivkumar, des American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446 für PH und des UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project) ermöglicht. Der in dieser Studie verwendete GNEXT microPET/CT-Scanner wurde durch einen NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1) finanziert.

Diese Studie verwendete anonymisierte Gewebeproben, die von nicht versagenden menschlichen Spenderherzen entnommen wurden, und wurde vom Institutional Review Board der University of California, Los Angeles (UCLA) genehmigt. Es wurden Proben von nicht versagenden Herzen entnommen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden. Die Herzen wurden druckperfundiert, in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und vor der Gewebeverarbeitung mit den folgenden Methoden abgebildet. Abbildung 1 fasst das Flussdiagramm der Reihenfolge der Studie zusammen. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Untersuchung im Mikromaßstab
<ol><li>Gewebereinigung mit modifiziertem Immunmarkierungs-fähiger 3D-Bildgebung von lösungsmittelfreigegebenen Organen (iDISCO+) Protokoll.<ol><li>Präparieren Sie 4 % PFA-fixiertes Gewebe mit einem Skalpell, das in die 3 mm × 16 mm × 25 mm Kammer für die konfokale Mikroskopie passt. Um dickeres Gewebe abzubilden, können zusätzliche Kammern und/oder Abstandshalter auf dem Objektträger gestapelt werden.</li>
		<li>Proben mit abgestuftem Methanol (MeOH) (20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 % MeOH in deionisiertem H2O [vol/vol]) für jeweils 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren dehydrieren.</li>
		<li>1 h bei RT mit 100 % MeOH waschen und bei RT unter Rühren über Nacht in 66 % Dichlormethan/33 % MeOH tauchen.</li>
		<li>Am nächsten Tag zweimal 1 h lang bei RT in MeOH (100 %) waschen, bei 4 °C kühlen und über Nacht bei 4 °C mit 5 % H2O2 in MeOH (vol/vol) behandeln.</li>
		<li>Rehydrieren Sie mit der abgestuften MeOH-Serie (80 %, 60 %, 40 % und 20 % MeOH) und waschen Sie in 0,01 mol/L PBS für jeweils 1 h bei RT unter Rühren.</li>
		<li>Waschen Sie das Taschentuch zweimal in 0,01 mol/L PBS mit 0,2 % Triton X-100 für 1 h bei RT.</li>
		<li>Bereiten Sie sich auf die Immunmarkierung vor, indem Sie 0,01 mol/l PBS, 20 % Dimethylsulfoxid (DMSO), 0,2 % Triton X-100 und 0,3 mol/l Glycin 2 Tage lang bei 37 °C unter Rühren permeabilisieren.</li>
		<li>0,01 mol/l PBS mit 10 % DMSO, 0,2 % Triton X-100 und 5 % normalem Eselserum für weitere 2 Tage bei 37 °C unter Rühren einbinden.</li>
		<li>Markierung mit einem primären Antikörper, der mit MeOH kompatibel ist, konjugiert mit Fluorophoren, verdünnt in 0,01 mol/l PBS mit 10 mg/ml Heparin (PTwH), 0,2 % Tween-20, 5 % DMSO und 3 % normalem Eselsserum für 3-4 Tage bei 37 °C unter Rührung.</li>
		<li>Die Antikörperlösung wird aufgefüllt und weitere 3-4 Tage bei 37 °C unter Rühren inkubiert.</li>
		<li>Nach 1-wöchiger Inkubation in Primärantikörperlösung 4 bis 5 Mal in PTwH über Nacht bei RT waschen.</li>
		<li>Inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper, der an in PTwH verdünnte Fluorophore, 3 % normales Eselsserum konjugiert ist, 3 Tage lang bei 37 °C unter Rühren.</li>
		<li>Die Sekundärantikörperlösung wird aufgefüllt und weitere 3 Tage bei 37 °C unter Rühren inkubiert.</li>
		<li>Nach 6-tägiger Inkubation in Sekundärantikörperlösung 4-5 Mal über Nacht bei RT in PTwH waschen.</li>
		<li>Dehydrieren Sie mit einer abgestuften MeOH-Serie (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % und 100 % MeOH). Die Probe kann über Nacht bei RT gelagert werden.</li>
		<li>In 66 % Dichlormethan/33 % MeOH 3 h bei RT unter Rühren inkubieren.</li>
		<li>Zweimal 15 min bei RT unter Rühren zweimal in 100% Dichlormethan waschen.</li>
		<li>Inkubieren und lagern Sie die Proben in Benzylether. Füllen Sie das Röhrchen, um zu minimieren, dass Luft die Probe oxidiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Bildgebung von gewebefreigelegten Proben<ol><li>Befestigen Sie eine Kammer mit Klebstoff auf einem Objektträger und tragen Sie Nagellack um den Umfang der Kammer auf. Für dickeres Gewebe können zusätzliche Kammern und/oder Abstandshalter auf dem Objektträger gestapelt werden.</li>
		<li>Legen Sie das gereinigte Gewebe in die Kammer, füllen Sie es mit Benzylether und bringen Sie ein Deckglas an.</li>
		<li>Tragen Sie Nagellack um das Deckglas auf, um eine Versiegelung zu erzeugen.</li>
		<li>Mit einem aufrechten konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit einer 5- oder 10-fachen Linse erhalten Sie Tilescan- und Z-Stapel-Bilder, um Bilder in einer Tiefe bis zum Arbeitsabstand des Objektivs zu erhalten.</li>
		<li>Aufnahme mit einer Auflösung von 1024 x 1024 unter Verwendung von Laserlinien, die für die Emissionsspektren der verwendeten Fluorophore geeignet sind. Die Autofluoreszenz der Muskeln ist mit der 488-nm-Laserlinie sichtbar.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Schrittweite der Z-Achse der Nyquist-Probenahme auf der Grundlage der numerischen Apertur des angegebenen Objektivs11 entspricht.</li>
		<li>Fügen Sie Bilder zusammen und verwenden Sie Software für die 3D-Visualisierung.</li>
		<li>Erstellen Sie Abbildungen mit MIP-Bildern (Maximum Intensity Projection) von Z-Stacks für einzelne und zusammengeführte Kanäle (Abbildung 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Immunhistochemie HINWEIS: Nachdem das Gewebe in Paraffin eingebettetwurde 22, wird das folgende Verfahren verwendet, um Objektträger für immunhistochemische Untersuchungen zu erstellen.<ol><li>Herstellung von Brechungsindex-Matching-Lösung (RIMS).<ol><li>Bereiten Sie 0,1 mol/l Phosphatpuffer vor, indem Sie 10,9 g Na2HPO4 (wasserfrei) und 3,1 g NaH2PO4 (Monohydrat) zu deionisiertem H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l (pH 7,4) hinzufügen. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem Filter und lagern Sie sie bei RT.</li>
			<li>Verdünnen Sie den Phosphatpuffer auf 0,02 mol/L.</li>
			<li>Lösen Sie Histodenz in 30 mL 0,02 mol/l Phosphatpuffer auf, indem Sie die Lösung 10 Minuten lang mit einem magnetischen Rührstab in der Endlagerflasche rühren, die verschlossen sein kann, um Verdunstung und Kontamination zu minimieren.</li>
			<li>Fügen Sie Natriumazid zu einer Gesamtkonzentration von 0,01 % (w/v) hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 ein.</li>
			<li>Passen Sie die RI an, indem Sie die Endkonzentration von Histodenz variieren.</li>
			<li>Lagern Sie die RIMS monatelang bei RT. Verwerfen, wenn eine mikrobielle Kontamination festgestellt wird. HINWEIS: Autoklavieren Sie KEINE Lösungen, die Natriumazid enthalten.</li>
		</ol></li>
		<li>Vorbereitung von Objektträgern für immunhistochemische Untersuchungen<ol><li>Erstellen Sie Schnitte mit einer Dicke von 5 μm mit dem Mikrotom. Wenden Sie einen Gewebeschnitt auf geladene Objektträger an.</li>
			<li>Entfernen Sie das Paraffin, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in >75%igem Xylol inkubieren. Schieben Sie die Objektträger für weitere 10 Minuten in einen zweiten Behälter mit Xylol.</li>
			<li>Entfernen Sie das Xylol, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 100 % EtOH, dann 5 Minuten lang 95 % EtOH und 5 Minuten lang 70 % EtOH eintauchen.</li>
			<li>Spülen Sie die Objektträger 5 min lang mit entionisiertem H2O ab.</li>
			<li>Tauchen Sie die Objektträger 25 Minuten lang bei 90-95 °C in einen Antigen-Retrieval-Puffer.</li>
			<li>Lassen Sie den Behälter 1 h lang unter Rühren auf RT abkühlen.</li>
			<li>Tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei 4 °C in Einweichpuffer (0,01 mol/L PBS + 0,4 % Triton X-100).</li>
			<li>Umkreisen Sie das Gewebe mit einem PAP-Stift. Geben Sie PBS zu jedem Objektträger und legen Sie ihn in eine befeuchtete Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger mit PBS bei RT unter Rühren für 5 min.</li>
			<li>Block mit Blockierungspuffer (0,01 mol/L PBS + 10% Eselserum + 0,1% TX-100) für 1 h unter Rühren.</li>
			<li>Inkubieren Sie mit einem Primärantikörper, der über Nacht bei 4 °C in einem Blockierungspuffer verdünnt ist.</li>
			<li>Lassen Sie die Dias am nächsten Tag 15 Minuten lang auf RT erwärmen.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 für 5 min.</li>
			<li>Mit einem in Blockierungspuffer verdünnten Sekundärantikörper 1 h bei RT unter Rühren inkubieren.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 für 5 min.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit 0,01 mol/L PBS für 5 min.</li>
			<li>Geben Sie 1 Tropfen RIMS mit einer Pipette und bringen Sie ein Deckglas an.</li>
			<li>Tragen Sie Nagellack um das Deckglas auf, um die Versiegelung zu erzeugen.</li>
			<li>Als Negativkontrolle ist eine Probe ohne den Primärantikörper durchzuführen, um das Fehlen einer spezifischen Färbung nachzuweisen.</li>
		</ol></li>
		<li>Bildgebung von immungefärbten Objektträgern<ol><li>Bilden Sie die Objektträger mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit 10x-, 20x- und 40x-Objektiven ab.</li>
			<li>Aufnahme mit einer Auflösung von 1024 x 1024 unter Verwendung von Laserlinien, die für die Emissionsspektren der verwendeten Sekundärantikörper geeignet sind.</li>
			<li>Erstellen Sie Abbildungen mit MIP-Bildern (Maximum Intensity Projection) von Z-Stacks für einzelne und zusammengeführte Kanäle (Abbildung 3).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Untersuchung auf der Mesoskala
<ol><li>Stereoskopische Dissektion<ol><li>Führen Sie feine Dissektionen durch, die sich auf winzige oder dünne Strukturen konzentrieren, wie z. B. den atrioventrikulären Knoten, die Arterie des atrioventrikulären Knotens und den Plexus des Herznervs (im Submillimeter- bis Millimeterbereich) entweder mit einer Schreibtischlampe mit Lupe, chirurgischen Teleskopen oder einem Stereomikroskop.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikro-CT-Untersuchung HINWEIS: Die CT-Bildgebung wird nach der Druckperfusion und -fixierung und in allen Stadien der Dissektion mit einem Mikro-Positronen-Emissions-Tomographie (PET)/CT-Scanner durchgeführt (Abbildung 4).<ol><li>Erwärmen Sie die CT-Röntgenquelle 25 Minuten lang, bevor Sie die Probe abbilden.</li>
		<li>Legen Sie die Herzprobe auf das Scannerbett.</li>
		<li>Bewegen Sie das Scannerbett in eine horizontale Position von 544 mm und eine vertikale Position von 14 mm, um das Herz im CT-Sichtfeld (FOV) zu zentrieren.</li>
		<li>Erfassen Sie ein CT-Bild bei 80 kVp, 150 μA, mit 720 Projektionen während einer Scanzeit von 1 Minute bei einer räumlichen Auflösung von 200 μm.</li>
		<li>Rekonstruieren Sie die CT-Daten mit einem Sichtfeld von 12 cm x 12 cm x 10 cm und einer Matrix von 600 x 600 x 500 Voxeln und speichern Sie sie als DICOM-Datei.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Untersuchung auf der Makroskala
<ol><li>Druckperfusion und Fixierung ANMERKUNG: Die Autoren modifizieren die zuvor beschriebenen Druckperfusions- und Fixationstechniken und wenden sie auf die nicht versagenden menschlichen Herzen an, die für eine Transplantation abgestoßen wurden 14,19,20,21.<ol><li>Verwenden Sie Pumpen mit hohem Durchfluss für die Perfusionsfixierung. Verwenden Sie entweder 100 % Ethanol14, 4 % PFA oder 10 % Formalin für das Fixiermittel. HINWEIS: Das Herz wird wiederhergestellt, wobei die aufsteigende Aorta, der Lungenstamm und die Vena cavae sowie die Lungenvenen so distal wie möglich reseziert und in Lösung23 der University of Wisconsin verabreicht werden.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei chirurgische Kanülen 20-24 Fr für die Rechts- und Linksherzperfusion. Für eine Rechtsherzperfusion kanülieren Sie die obere Hohlvene und platzieren Sie einen Schlot am Lungenstamm oder in der Lungenarterie mit halb geschnittenen Kunststoffspritzen der Größe 12-30 ml, die an Dreiwege-Absperrhähnen befestigt sind.</li>
		<li>Verschließen Sie die untere Hohlvene und die andere Lungenarterie mit einem Garn, nachdem Sie eine verriegelte, halb geschnittene Kunststoffspritze oder ein 1,5-5,0-ml-Zentrifugenröhrchen in geeigneter Größe eingesetzt haben.<ol><li>Für eine antegrade Perfusion des linken Herzens kanülieren Sie eine der Lungenvenen und platzieren Sie einen Entlüftungsöffnung am distalen geschnittenen Ende der Aorta mit den halb geschnittenen Kunststoffspritzen der Größe 12-30 ml mit Luer-Lock-Spitzen, die an Dreiwege-Absperrhähnen befestigt sind.</li>
			<li>Bei einer retrograden Perfusion des linken Herzens wird einer der Aortenbogenäste kanüliert und an einem anderen Ast des Aortenbogens ein Entlüftungsöffnung angelegt. Legen Sie die Spitzen der Kanülen in beide Herzkammern.</li>
		</ol></li>
		<li>Verschließen Sie andere Gefäßöffnungen mit Schnur, nachdem Sie eine verriegelte halbgeschnittene Kunststoffspritze oder ein 1,5-5,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in geeigneter Größe eingeführt haben. Verwenden Sie eine dünne Gaze, um den Einführteil der Spritzen/Schläuche/Kanülen abzudecken, um ein Auslaufen und Verrutschen zu verhindern. Beheben Sie große Lecks mit Nähten, Bändern oder Verklumpungen. Kleine Undichtigkeiten sind zulässig.</li>
		<li>Hänge das Herz in einen Plastikbehälter.</li>
		<li>Verbinden Sie den 22-24 Fr Weichplastikschlauch mit jeder Kanüle und führen Sie das andere Ende des Schlauchs in den mit dem Fixiermittel gefüllten Behälter ein.</li>
		<li>Zirkulieren Sie das Fixiermittel durch den Rechts- und Linksherzkreislauf unter Verwendung einer High-Flow-Pumpe, die auf ca. 100-300 ml/min für das rechte Herz und 200-400 ml/min für das linke Herz eingestellt ist, um etwa 20 mmHg im rechten Ventrikel bzw. 80 mmHg im linken Ventrikel zu erreichen.</li>
		<li>Halten Sie die Durchblutung 24 Stunden lang bei 4 °C.</li>
		<li>Waschen Sie das Herz mit 0,01 mol/L PBS für 30 min unter viermaligem Rühren.</li>
		<li>Lagern Sie das Herz in 0,01 mol/L PBS/0,02 % Natriumazid bei 4 °C. HINWEIS: Die Druck-Perfusions-Fixierung ist nur bei einem frischen Herzen wirksam, nicht bei einem Herzen, das von einem einbalsamierten Leichnam geborgen wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Grobe Sektion<ol><li>Führen Sie in jeder Phase der Dissektion eine progressive Dissektion mit fotografischen Aufnahmen durch.</li>
		<li>Um die klinische Relevanz zu erhalten, ist besonders darauf zu achten, dass Strukturen nicht verzerrt/verformt werden, um die physiologische Morphologie des Herzens zu erhalten.</li>
		<li>Bilden Sie Zielstrukturen mit klinisch relevanter Orientierung ab, z. B. mit rechter anteriorer Schrägausrichtung.</li>
	</ol></li>
	<li>Fotografie<ol><li>Platzieren Sie das druckdurchblutete und feste Herz auf einem Stativ mit einer Plattform, die mit mehreren Zinken montiert ist und um 360° gedreht werdenkann.</li>
		<li>Fotografieren Sie das Herz mit einer digitalen Spiegelreflexkamera (Abbildung 5)24 und verwenden Sie dabei mehrere Leuchtdioden-Lichtpaneele, die auf den C-Stativen angebracht sind, und ein breites schwarzes Duvetyn-Hintergrundtuch.</li>
		<li>Fotografieren Sie mit dem Objektiv mit einer langen Brennweite (200 mm) für einen Arbeitsabstand von 4-6 Fuß, um die Verzerrung des Motivs zu minimieren14.</li>
	</ol></li>
	<li>Anaglyphen<ol><li>Um Anaglyphenbilder anzuzeigen, rekonstruieren Sie ein Paar von Fotos oder volumengerenderten Bildern aus CT-Datensätzen mit einem Unterschied von 10° im Rotationswinkel auf der horizontalen Ebene.</li>
		<li>Konvertieren Sie einen Satz dieser zweidimensionalen (2D) Bilder, die als Stereogramm bezeichnet werden, in Anaglyphen mit der Freeware16.</li>
		<li>Um eine Anaglyphe anzuzeigen, verwenden Sie eine rote/cyanfarbene Brille.</li>
	</ol></li>
	<li>Photogrammetrie HINWEIS: Photogrammetrie ist die angewandte Wissenschaft der Erzeugung einer dreidimensionalen oberflächengerenderten Rekonstruktion aus mehreren zweidimensionalen Fotos, die aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen wurden17.<ol><li>Hängen Sie die Probe auf C-Stative auf oder legen Sie sie auf den Rotationstisch, um mit einem Smartphone Hunderte von multidirektionalen Fotos zu erhalten.</li>
		<li>Generieren Sie das 3D-Modell im FBX-Format mit handelsüblicher Software.</li>
	</ol></li>
	<li>CT-Untersuchung HINWEIS: CT-Scans können nach der Druckperfusion und -fixierung und in jedem Stadium der Dissektion durchgeführt werden.<ol><li>Hängen Sie die Herzprobe an einen Stab, der über der Oberseite des Behälters platziert ist. Um zu verhindern, dass das Herz während des Scans schwingt, stützen Sie die Basis des Herzens mit Kunststoffzinken ab, die am Boden des Behälters befestigt sind. So dient die Luft als negativer Kontrast.</li>
		<li>Führen Sie den CT-Scan mit einem handelsüblichen Multidetektor-Reihen-CT-Scanner mit den folgenden Parametern durch: Röhrenspannung von 120 kV, Röhrenstrom von 800-900 mA und eine Gantry-Drehung von 280 ms. Das Dosislängenprodukt beträgt im Allgemeinen 500-1200 mGy.cm.</li>
		<li>Rekonstruieren Sie axiale Bilddaten mit den folgenden Parametern: eine Schnittdicke, 0,6 mm; ein inkrementelles Intervall von 0,3 mm; ein möglichst kleines Sichtfeld (in der Regel 100-200 mm); und eine Matrix, 512 × 512.</li>
	</ol></li>
	<li>Virtuelles Sezieren<ol><li>Analysieren Sie die CT-Scanbilder mit kommerziell erhältlicher Software, um virtuelle Präparierbilder zu erstellen. ANMERKUNG: Die virtuelle Dissektion ist eine Modifikation des Volumen-Rendering-Prozesses, bei dem der Fokus auf die Wände der Herzkammern und Gefäße18 verlagert wird. Bei diesem Prozess wird durch manuelles Thresholding die erweiterte Kammer praktisch aus den ursprünglichen Datensätzen entfernt.</li>
		<li>Visualisieren Sie die nicht verbesserten Wände, Septen und Ventile mit virtueller Dissektion, um Bilder zu erzeugen, die der groben Dissektion ähneln. Im Gegensatz zur groben Dissektion der Herzproben sind die Schnittebenen bei der virtuellen Dissektion praktisch unbegrenzt. Fast jede Ansicht kann neu erstellt werden, um die gewünschten Strukturen nach Bedarf zu visualisieren.</li>
	</ol></li>
	<li>3D-Druck<ol><li>Öffnen Sie die kompatible Datei der Herzprobe in der 3D-Druckersoftware.</li>
		<li>Verwenden Sie das Profil von 0,10 mm Fast DETAIL für die Druckeinstellungen im 3D-Drucker und reduzieren Sie die Druckgeschwindigkeit auf 20 mm/s. Aktivieren Sie Stützmaterial generieren.</li>
		<li>Verwende das Profil des TPU-Filaments für "Filamenteinstellungen" im 3D-Drucker.</li>
		<li>Verwenden Sie das Profil der Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 Düse für "Druckereinstellungen" im Drucker.</li>
		<li>Nachdem das Schneiden abgeschlossen ist, speichern Sie die BGCODE-Datei auf einem USB-Flash-Laufwerk für den 3D-Druck.</li>
		<li>Verwenden Sie das 1,75 mm TPU-Filament für den 3D-Druck der menschlichen Herzprobe. Trocknen Sie das TPU-Filament vor dem 3D-Druck 6 Stunden lang mit einem Filamenttrockner.</li>
		<li>Um die Filamentspannung während des 3D-Drucks zu reduzieren, platzieren Sie die Filamentspule auf einem Spulenhalter mit eingebautem Lager, um die Rotation der Filamentspule zu erleichtern. Führen Sie den 3D-Druck mit einem handelsüblichen 3D-Drucker mit einem strukturierten, pulverbeschichteten Stahlblech durch.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig Stützmaterialien, wenn der 3D-Druck abgeschlossen ist.</li>
	</ol></li>
</ol>

Umfassende 3D-Analyse menschlicher Herzen von der Mikro- bis zur Makroskala

<ol>
	<li>Tawara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+reizleitungssystem+des+s&#228;ugetierherzens.+Eine+anatomisch-histologische+studie+&#252;ber+das+atrioventrikularb&#252;ndel+und+die+purkinjeschen+f&#228;den.">Das reizleitungssystem des s&#228;ugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie &#252;ber das atrioventrikularb&#252;ndel und die purkinjeschen f&#228;den.</a> Jena: Gustav fischer. , (1906).</li><li>Stephenson, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+peripheral+neural+circuits+that+regulate+heart+rate+using+optogenetic+and+viral+vector+strategies.">Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies.</a> Nature Communications. 10, 1944 (2019).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Mcalpine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+and+coronary+arteries:+An+anatomical+atlas+for+clinical+diagnosis,+radiological+investigation,+and+surgical+treatment.">Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment.</a> Springer-verlag. , (1975).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoscopic+three-dimensional+anatomy+of+the+heart:+Another+legacy+of+dr.+Wallace+a.+Mcalpine.">Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine.</a> Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).</li><li>Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereogram+of+the+living+heart,+lung,+and+adjacent+structures.">Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures.</a> Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).</li><li>Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photogrammetry+of+perfusion-fixed+heart:+Innovative+approach+to+study+3-dimensional+cardiac+anatomy.">Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy.</a> JACC Case Rep. 21, 101937 (2023).</li><li>Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+dissection:+Emerging+as+the+gold+standard+of+analyzing+living+heart+anatomy.">Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30 (2020).</li><li>Thomas, A. C., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+cardiac+pathology+using+perfusion-fixation.">The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation.</a> Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).</li><li>Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+pressure+fixation+apparatus+for+hearts.">Controlled pressure fixation apparatus for hearts.</a> Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).</li><li>Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visible+heart(r)+project+and+free-access+website+'atlas+of+human+cardiac+anatomy.">The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy.</a> Europace. 18, 163-172 (2016).</li><li>Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+staining+for+paraffin-embedded+lung+cancer+tissue.">Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue.</a> J Vis Exp. (201), e65850 (2023).</li><li>Tripathy, S., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+organ+preservation:+Current+prospective+and+challenges.">Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges.</a> Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+cardiac+anatomy+(anatomical+basis+of+cardiac+interventions.+Vol.+1).">Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1).</a> Cardiotext. , (2022).</li><li>Crosado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenoxyethanol-based+embalming+for+anatomy+teaching:+An+18+years'+experience+with+crosado+embalming+at+the+university+of+otago+in+new+zealand.">Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand.</a> Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).</li><li>Titmus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+creation+of+photorealistic+3d+cadaveric+models+using+photogrammetry.">A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry.</a> J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).</li><li>Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+applications+of+virtual+reality+in+cardiovascular+medicine.">Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine.</a> JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).</li><li>Maresky, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+reality+and+cardiac+anatomy:+Exploring+immersive+three-dimensional+cardiac+imaging,+a+pilot+study+in+undergraduate+medical+anatomy+education.">Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education.</a> Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+three-dimensional+cardiac+imaging+using+leading-edge+holographic+display.">Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display.</a> Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).</li></ol>

Die vorliegende Studie zeigt die umfassende Pipeline zur Analyse von Proben, die aus ganzen menschlichen Herzen gewonnen wurden. Repräsentative Befunde zeigen mikro- bis makroskalige anatomische Untersuchungen, die routinemäßig an einem einzelnen Herzen durchgeführt werden. Da eine menschliche Herzprobe äußerst wertvoll ist, ist ein Multiskalenansatz ideal und effektiv, um keine Teile der Probe zu verschwenden, indem mehrere Protokolle für verschiedene Zwecke angewendet werden, einschließlich der Entdeckung in de...

Da die Funktion der Form folgt, ist das Verständnis der Architektur des Herzens von grundlegender Bedeutung für das Verständnis seiner Physiologie. Obwohl zahlreiche Untersuchungen die kardiale Anatomie von der Mikro- bis zur Makroskala aufgedeckt haben 1,2,3, sind mehrere Fragen ungeklärt, insbesondere solche, die sich auf die menschliche Herzanatomie beziehen. Dies liegt zum Teil daran, dass grundlegende Studien, die sich auf die funktionelle Anatomie konzentrierten, im Allgemeinen Tierherzen verwendeten 4,5,6, die sich oft von menschlichen Herzen unterscheiden 1,7,8. Darüber hinaus neigt jede einzelne Studie, auch die mit menschlichen Herzproben, dazu, sich auf sehr spezifische Strukturen zu konzentrieren, was es schwierig macht, die Ergebnisse auf den Kontext des gesamten Herzens anzuwenden. Dies gilt umso mehr, wenn die fokussierten Strukturen auf Mikro- oder Mesoskalen liegen, wie z. B. der Perinexus9 und die ganglionierten Plexus10.
In diesem Zusammenhang bietet die systemische Strukturuntersuchung des menschlichen Herzens, das für eine Transplantation abgestoßen wurde, eine einzigartige und seltene Gelegenheit, einen umfassenden Atlas der kardialen Strukturen im Fokus über mikroskopische und makroskopische Skalen zu erhalten11. Zu den mikroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die Gewebereinigung (modifizierte Immunmarkierungs-fähige dreidimensionale (3D) Bildgebung von lösemittelfreigeschalteten Organen, iDISCO+)12,13 und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsprotokollen gehören stereoskopische Dissektion, Makrofotografie und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die grobe Dissektion14, die Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie)15,16,17, die CT, die virtuelle Dissektion18 und der 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens17. Zur Vorbereitung der makroskopischen Untersuchung wird eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten 14,19,20,21. Die kombinierte Anwendung dieser Techniken ist einzigartig und entscheidend, um unterschiedliche anatomische Merkmale im Kontext der 3D-Architektur des menschlichen Herzens zu korrelieren.
Da die Möglichkeit, eine nicht-pathologische menschliche Herzprobe zu erhalten, extrem begrenzt ist, maximiert ein hierin beschriebener Multiskalenansatz die Verwendung der Probe. Durch die Anwendung verschiedener Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden, werden repräsentative Ergebnisse dem Leser veranschaulichen, wie die Ergebnisse für verschiedene Zwecke genutzt werden können, einschließlich der Entdeckung in der wissenschaftlichen Forschung11 (umfassende Analysen der kardialen Innervation, der Verteilung ganglionierter Plexus), der Verbesserung klinischer Verfahren (Simulation für chirurgische und interventionelle Ansätze) und der anatomischen Ausbildung (reale 3D-Demonstration der Herzanatomie).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>713-605-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle - Cy3 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>139 103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm</td>
			<td>NinjaTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>Decon laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNEXT PET/CT</td>
			<td>SOFIE Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN (black edition)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Imaris 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>Sunjin Labs</td>
			<td>iSpacer 3mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIRI Engine</td>
			<td>KIRI Innovation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAD-2 - Vertical &#38; Multi-channels Peristaltic Pump</td>
			<td>LONGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightview XL&#160;</td>
			<td>Brightech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (Certified ACS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D850</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4</td>
			<td>NinjaTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa MK4 3D printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycam</td>
			<td>Polycam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrusaSlicer 2.7.1</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARA-Engine</td>
			<td>pita4 mobile LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaniverse</td>
			<td>Niantic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antiface Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>7144.8-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOMATOM Definition AS</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Field Surgi-Spec Telescopes,&#160;</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System SZ61</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoPhoto Maker</td>
			<td>Free ware developed by Masuji Suto</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziostation2</td>
			<td>Ziosoft, AMIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pipeline for multi-scale three-dimensional anatomic study of the human heart

Die detaillierte Untersuchung von nicht versagenden menschlichen Herzen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden, bietet eine einzigartige Möglichkeit, strukturelle Analysen auf mikroskopischer und makroskopischer Skala durchzuführen. Zu diesen Techniken gehören das Tissue Clearing (modifizierte Immunmarkierungs-gestützte dreidimensionale (3D) Bildgebung von Organen, die durch Lösungsmittel freigegeben wurden) und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsverfahren gehören stereoskopische Dissektion und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsverfahren gehören grobe Dissektion, Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie), CT und 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens. Vor der makroskopischen Untersuchung kann eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt werden, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten. Die Anwendung dieser Techniken in Kombination zur Untersuchung des menschlichen Herzens ist einzigartig und entscheidend für das Verständnis der Beziehung zwischen unterschiedlichen anatomischen Merkmalen wie koronaren Gefäßen und Myokardinnervation im Kontext der 3D-Architektur des Herzens. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden im Detail und enthält repräsentative Ergebnisse, um die Fortschritte in der Erforschung der menschlichen Herzanatomie zu veranschaulichen.

As function follows form, understanding the architecture of the heart is fundamental for appreciation of its physiology. Although numerous investigations have revealed cardiac anatomy from micro- to macroscales1,2,3, multiple questions remain unresolved, especially those related to human cardiac anatomy. This is in part because basic studies focusing on functional anatomy generally utilized animal hearts4,5,6, which are often distinct from human hearts1,7,8. Furthermore, each individual study, even those using human heart samples, tends to focus on very specific structures, which renders it difficult to apply the findings in the context of the whole heart. This is even more so if the focused structures are at micro- or mesoscales, such as the perinexus9 and ganglionated plexuses10.
In this context, systemic structural study of the human heart rejected for transplantation provides a unique and rare opportunity to obtain a comprehensive atlas of cardiac structures in focus across microscopic and macroscopic scales11. Microscopic examination protocols include tissue clearing (modified immunolabeling-enabled three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs, iDISCO+)12,13, and immunohistochemical staining. Mesoscopic examination protocols include stereoscopic dissection, macro photography, and micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopic examination protocols include gross dissection14, photography (including anaglyphs and photogrammetry)15,16,17, CT, virtual dissection18, and 3D printing of the physically or virtually dissected or whole heart17. In preparation for&#160;macroscopic examination, pressure-perfusion fixation is&#160;performed to maintain the 3D architecture and physiologically relevant morphology of the heart14,19,20,21.&#160;The combined application of these techniques is unique and crucial to correlate distinct anatomic features in the context of the 3D architecture of the human heart.
As the opportunity to obtain a non-pathological human heart sample is extremely limited, a multi-scale approach described herein maximizes the use of the sample. By applying various procedures described below, representative results will illustrate to the reader how the findings can be utilized for multiple purposes, including discovery in scientific research11 (comprehensive analyses of cardiac innervation, distribution of ganglionated plexuses), improvement of clinical procedures (simulation for surgical and interventional approaches), and anatomical education (real 3D demonstration of cardiac anatomy).

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der menschlichen Herzanatomie durch Multiskalenanalyse von Herzen

Pipeline für dreidimensionale multidimensionale anatomische Untersuchung des menschlichen Herzens

Knowing cardiac anatomy is fundamental to understanding cardiac physiology. Studies of functional anatomy have spanned the micro to macro scales, but have largely used animal hearts. Systematic study of donor human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to develop a comprehensive atlas that spans the microscopic to macroscopic scales.Through study of the human heart across different scales, we've demonstrated the exquisite innervation of the heart, identified cardiac anatomic structures to improve surgical and interventional approaches, and developed resources for anatomic education. The advantage of studying the human heart across different scales is that the detailed study of microscopic structures may be placed in the context of gross anatomy. The use of pressure profusion fixation maintains the physiologically relevant morphology of the heart.

Untersuchungen im Mikromaßstab Die Anwendung von Tissue Clearing ermöglicht die Bildgebung größerer Gewebemengen in 3D mittels konfokaler Mikroskopie. Im Herzen können Ganglien mit Herzneuronen und die neuronale Musterung der Myokardinnervation sichtbar gemacht werden (Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt ein konfokales Bild des Myokards des linken Ventrikels des Menschen, immungefärbt für Nerven und glatte Muskelzellen. Es wird festgestell...

Dieses Protokoll stellt eine umfassende Pipeline zur Analyse von Proben aus menschlichen Herzen dar, die sich über die mikroskopische und makroskopische Skala erstrecken.

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic ...

pipeline-for-multi-scale-three-dimensional-anatomic-study-human

Research

JoVE Journal

Biology

Pipeline for Multi-Scale Three-Dimensional Anatomic Study of the Human Heart

236 Aufrufe.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Die Kenntnis der Herzanatomie ist für das Verständnis der Herzphysiologie von grundlegender Bedeutung. Studien zur funktionellen Anatomie haben sich über die Mikro- bis zur Makroskala erstreckt, aber hauptsächlich Tierherzen verwendet. Die systematische Untersuchung von menschlichen Spenderherzen, die für eine Transplantation abgelehnt wurden, bietet eine einzigartige Gelegenheit, einen umfassenden Atlas zu entwickeln, der die mikroskopische bis makrosko...

Serie: Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der menschlichen Herzanatomie durch Multiskalenanalyse von Herzen

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic and macroscopic scales. These techniques include tissue clearing (modified immunolabeling-enabled three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs) and immunohistochemical staining. Mesoscopic examination procedures include stereoscopic dissection and micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopic examination procedures include gross dissection, photography (including anaglyphs and photogrammetry), CT, and 3D printing of the physically or virtually dissected or whole heart. Before macroscopic examination, pressure-perfusion fixation may be performed to maintain the 3D architecture and physiologically relevant morphology of the heart. The application of these techniques in combination to study the human heart is unique and crucial in understanding the relationship between distinct anatomic features such as coronary vasculature and myocardial innervation in the context of the 3D architecture of the heart. This protocol describes the methodologies in detail and includes representative results&#160;to illustrate progress in the research of human cardiac anatomy.

This protocol presents a comprehensive pipeline to analyze samples obtained from human hearts that span the microscopic and macroscopic scales.

Forschung

Biologie

Enhanced 3D Confocal Imaging of Solvent-Cleared Human Heart Tissues

To begin, use a scalpel to dissect 4%paraformaldehyde-fixed human heart tissue to fit within the chamber for confocal microscopy. Dehydrate the heart specimens in a graded methanol series for one hour each at room temperature with agitation, followed by overnight immersion in a 66%dichloromethane and 33%methanol solution with agitation. The next day, bleach the sample by performing the indicated steps.Then rehydrate the specimen with a graded methanol series for one hour each with agitation. After immunolabeling, perform the following steps to prepare the tissue for imaging. Affix a chamber containing adhesive to a slide and apply nail polish around the perimeter of the chamber.Turn on the upright laser scanning confocal microscope equipped with a 5X lens. Using laser lines appropriate for the emission spectra of the fluorophores used, acquire Tile scan and z-stack images at a resolution of 1024 by 1024. At the microscale level, tissue clearing of heart samples allows visualization of ganglia containing cardiac neurons and the neural patterning of myocardial innervation.

Verbesserte konfokale 3D-Bildgebung von lösungsmittelfreiem menschlichem Herzgewebe

Advanced Techniques in Cardiac Visualization from Gross Dissection to Virtual Reconstruction

After turning on a stereo microscope, perform delicate dissections on paraformaldehyde-fixed human heart tissue, focusing on structures such as the atrioventricular node, atrioventricular node artery, and cardiac nerve plexus. Place the heart sample on the scanner bed to acquire a CT image of the heart specimen. Using a 20 to 24 French surgical cannula, cannulate the superior vena cava for right heart perfusion.Then, occlude the inferior vena cava and another pulmonary artery with twine. Next, perform a progressive dissection of the heart tissue with photographic recordings at each stage of dissection. Using multiple light-emitting diode light panels set on C-stands with a wide black duvet and background cloth, photograph the heart with a digital single-lens reflex camera.Suspend the heart sample on a rotation table to obtain hundreds of multi-directional photographs with a smartphone. On Scaniverse and Polycam software, generate the 3D model of the heart in FBX format. Suspend the heart sample from a bar across the top of the container.Use a multi-detector row CT scanner to conduct CT scans of the heart. After generating virtual dissection images of the heart, visualize the non-enhanced walls, septa, and valves with virtual dissection to produce images similar to gross dissection.